董 潔， 方玉婷， 郭立瑋

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥復(fù)方分離工程重點實驗室，江蘇南京210029)

中藥復(fù)方提取物本質(zhì)上是一種化學(xué)復(fù)雜體系，其中包括“基本活性物質(zhì)”以及與其共存的“伴生物質(zhì)”［1］。目前所采用的水提醇沉，樹脂吸附，膜分離等提取、精制手段其目的都是去除提取物中的伴生物質(zhì)，保留基本活性物質(zhì)。以上幾種方法因各自技術(shù)原理不同，不僅對復(fù)方中指標性成分保留率不同且所除去的伴生物質(zhì)的種類與多少也有差異。鑒于物化參數(shù)變化是伴生物質(zhì)除去的這一微觀過程的綜合表征，本實驗以芍藥甘草湯為試驗體系，以指標性成分的含量以及物化參數(shù)為指標，探索不同的提取、精制方法對芍藥甘草湯體系中“基本活性物質(zhì)”以及“伴生物質(zhì)”的影響。

1 儀器與藥品

高效液相色譜儀(Waters515泵，WaterU6K進樣器，Waters2487紫外檢測器，JS－3030江申通用漢化色譜工作站);ShimazhuLibrorAEL－40SM(十萬分之一)電子天平(日本島津)，PHSJ－4A實驗室pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，DDSJ－308A電導(dǎo)率儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，SZD－2型智能化散射光濁度儀(上海自來水設(shè)備工程公司)，NDJ－1型旋轉(zhuǎn)黏度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);LDZ5－2型自動平衡離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。

所用藥材均購自南京市藥材公司，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》2005版一部的規(guī)定;芍藥苷對照品(供含量測定用 批號110715－200212)，甘草酸對照品(供含量測定用批號110731－200306)，甘草苷對照品(供含量測定用 批號 111610－200604)均購自中國藥品生物制品檢測所;甲醇、乙腈為色譜純(江蘇漢邦科技有限公司)，其余試劑均為分析純。

2 提取工藝

按處方比例稱取各味藥，浸泡0.5 h，加水煎煮3次:第1次加10倍量水，煎煮1 h;第2次加8倍量水，煎煮1 h;第3次加8倍量水，煎煮1 h，并分別用300目濾布濾過，合并濾液，得濃度為0.04 g生藥/mL的水提液，待用。

3 精制工藝

水提液采用醇沉法、離心法、大孔樹脂吸附法、絮凝法、微濾法、超濾法等幾種常用的分離工藝精制，比較了不同精制液中指標性成分(芍藥苷、甘草苷、甘草酸)含量，以及物理化學(xué)參數(shù)(pH、電導(dǎo)率、濁度、黏度)。

3.1 醇沉法 采用正交設(shè)計法對醇沉工藝進行優(yōu)選，確定最佳醇沉工藝為:取水提液1 000 mL濃縮至1.5 g生藥/mL，不斷攪拌該濃縮液同時緩緩加入計算量的乙醇至含醇量達到70%，醇沉?xí)r間14 h，濾過，取上清液，揮至無醇味后，用蒸餾水定容至1 000 mL。

3.2 離心法 取水提液1 000 mL離心(3 000 r/min，12 min)，傾出上清液并用蒸餾水定容至1 000 mL。

3.3 大孔樹脂吸附法 以芍藥苷、甘草苷、甘草酸三種成分的吸附量為指標通過考察五種不同型號樹脂的靜態(tài)吸附以及動態(tài)吸附－洗脫選擇最佳樹脂為HPD100。同時，以上述3種成分的保留率為指標通過單因素考察確定最佳工藝為:取水提液1 000 mL并濃縮至濃度為0.05 g生藥/mL，取該濃縮液以1.5 mL/min的流速通過已預(yù)處理的HPD100樹脂柱(樹脂床的體積約125 mL)，先用500 mL水洗脫，再用70%乙醇500 mL洗脫，收集醇洗脫液，揮至無醇味后，用蒸餾水定容至1 000 mL待用。

3.4 絮凝法 取水提液1 000 mL濃縮至0.16 g生藥/mL，并加殼聚糖溶液(殼聚糖－醋酸－水=1∶1∶100)20 mL，靜置24 h，過濾，取濾液并用蒸餾水定容至1 000 mL待用。

3.5 微濾法 取水提液1 000 mL離心(3 000 r/min，12 min)，傾出上清液并用孔徑為0.2 μm的中空聚偏氟乙烯膜組件以錯流方式進行循環(huán)微濾，待微濾液收集到800 mL后，加入200 mL水，繼續(xù)微濾直至收集到1 000 mL為止。

3.6 超濾法 取水提液1 000 mL按3.5項進行微濾后，用截留分子量為1～3萬的中空聚砜纖維膜組件以錯流方式進行循環(huán)超濾，待超濾液收集到約800 mL時，加入200 mL水，繼續(xù)超濾，至收集到1 000 mL為止。

4 指標性成分含量及物理化學(xué)常數(shù)測定

4.1 pH測定 取樣品20 mL，以校正過的精密PHSJ－4A實驗室pH計測定樣品的pH值。

4.2 電導(dǎo)率測定 取樣品20 mL，在溶液溫度為20℃時，測定其電導(dǎo)率。

4.3 濁度測定 取樣品50 mL，以SZD－2型智能化散射光濁度儀測定樣品的濁度值。

4.4 黏度測定 取樣品20 mL，以NDJ－1型旋轉(zhuǎn)黏度計測定樣品在20℃時的黏度值。

4.5 固含率的測定 精密移取樣品20 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿(W1)中，水浴蒸干，于105℃烘箱中干燥3 h，置干燥器中冷卻0.5 h，迅速稱重(W2)，計算固含率。固含率(mg/mL)=(W2－W1)/20。

4.6 指標性成分含量測定方法

4.6.1 芍藥苷測定色譜條件［2］69色譜柱為 Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為乙腈 －0.1%磷酸溶液(13∶87)，檢測波長為230 nm，流速為1.0 mL/min。

4.6.2 甘草苷測定色譜條件［2］59－60色譜柱:Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為乙腈 －1.1%冰醋酸(1∶4)，檢測波長為276 nm，流速為1.0 mL/min。

4.6.3 甘草酸測定色譜條件［2］59－60色譜柱:Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為甲醇 －0.2 mol/mL 醋酸銨溶液－冰醋酸(67∶33∶1.5);檢測波長為250 nm，流速為1.0 mL/min。

以上色譜條件經(jīng)方法學(xué)考察，在所選定的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性均良好。

表1 固含及指標性成分含量測定結(jié)果

5 結(jié)果

5.1 固含及指標性成分含量測定結(jié)果 從固含來看，芍藥甘草湯分別經(jīng)過上述幾種方法處理后固含明顯減少，幾種精制液固含由低到高的順序為:大孔樹脂洗脫液＜醇沉液＜超濾液＜絮凝液＜微濾液＜離心液。從指標性成分保留率來看，不同的精制方法對指標性成分的保留率不盡相同。如:對芍藥苷而言微濾法和離心法的保留率較高，但超濾法和絮凝法較低。對甘草苷、甘草酸而言離心法較為理想但超濾法的保留率較低。從浸膏中指標性成分含量來看，由于不同的精制方法對指標性成分的保留率不同以及不同精制方法的出膏率也不同，最終導(dǎo)致不同浸膏中指標性成分的含量存在差異。綜上所述，幾種方法對芍藥甘草湯都有精制作用，但通過不同方法精制后芍藥甘草湯體系中指標性成分的含量以及各指標性成分之間的比例都有明顯改變。這種改變是否會影響芍藥甘草湯整體藥效，有待從藥代動力學(xué)以及藥效學(xué)做進一步研究。

5.2 物理化學(xué)參數(shù)測定結(jié)果

5.2.1 pH、黏度 由圖1可知芍藥甘草湯水提液和不同精制液的黏度變化不大。但pH在4～6有明顯波動，其中超濾液和微濾液的pH最低，而大孔樹脂精制液pH最高。pH不同有可能改變化學(xué)體系中蛋白質(zhì)所帶電荷數(shù)，以及各成分間的絮凝，沉降性能和過濾性能。有文獻報道由于給藥體系的pH值不同可以改變藥物尤其是弱電解質(zhì)藥物(如鹽酸小檗堿)的解離度，從而影響藥物透過生物膜的難易程度，未解離的分子型藥物比離子型藥物易于透過生物膜［3］296。

5.2.2 電導(dǎo)率、濁度 濁度是表明液體澄清度的指標，泥沙，藥渣碎片，微粒以及沒有用的大分子膠體都能增加液體的濁度。由圖2可知經(jīng)過不同的方法處理后芍藥甘草湯體系的濁度值大幅度下降，該結(jié)果表明幾種方法都能除去體系中懸浮顆粒和膠體物質(zhì)，提高澄清度。其中大孔樹脂吸附法，超濾法，微濾法效果尤為明顯。

圖1 pH、黏度測定結(jié)果

圖2 電導(dǎo)率、濁度測定結(jié)果

電導(dǎo)率是衡量溶液體系離子多少的一個指標，也是描述膠體溶液體系變化的重要指標，與中藥提取液中的帶電膠體粒子(如蛋白和鞣質(zhì))密切相關(guān)。圖2表明除離心液外，其他幾種精制液的電導(dǎo)率較水提液都有改變。其中醇沉液、大孔樹脂洗脫液、超濾液、絮凝液電導(dǎo)率有所降低，且大孔樹脂洗脫液降低尤為明顯，而微濾液的電導(dǎo)率則有所升高。有研究認為:形成離子對可促進帶電藥物的吸收。離子對在溶液中通過靜電吸引所形成中性物質(zhì)使電荷消失，藥物的理化性質(zhì)、親脂性增強，易于藥物透過生物膜。因而電導(dǎo)率是影響溶液中藥物吸收的因素之一［3］29。

6 討論

綜上所述，芍藥甘草湯經(jīng)過不同的方法處理后其物質(zhì)組成發(fā)生了很大的改變。那么如何對不同的精制方法進行科學(xué)評價?有文獻報道以指標性成分含量作為評價指標，但從本文的試驗結(jié)果來看，由于每一種精制方法對三種指標性成分的保留率不盡相同，因此，僅以某種指標性成分含量的高低作為評價指標缺乏一定的合理性。又有文獻報道［4］伴生物質(zhì)可改變基本活性物質(zhì)的理化性質(zhì)，從而影響生物藥劑學(xué)參數(shù)，特別影響活性物質(zhì)從藥物處方或植物提取物中的溶出和進一步吸收。試驗結(jié)果表明，不同的精制液的物理化學(xué)參數(shù)有明顯的差異，也即芍藥甘草湯經(jīng)過不同的方法精制后，伴生物質(zhì)發(fā)生了明顯的改變，那么，這種伴生物質(zhì)的改變將怎樣影響活性物質(zhì)在體內(nèi)的吸收以及對活性物質(zhì)從提取物中溶出有何影響我們正在做進一步研究，試圖從復(fù)雜的數(shù)據(jù)中挖掘出物理化學(xué)參數(shù)和生物藥劑學(xué)的相關(guān)性，嘗試從物理化學(xué)參數(shù)的角度為中藥的精制分離方法建立一種合理的評價體系。

［1］郭立瑋，潘林梅，朱華旭.中藥提取物伴生物質(zhì)的生物藥劑學(xué)特性及其制劑學(xué)意義［J］.中草藥，2007，38(8):1281.

［2］中國藥典［S］.2005:69.

［3］蘇德森.物理藥劑學(xué)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:296.

［4］Rainer H M，Gesine E H著，胡晉紅主譯.現(xiàn)代給藥系統(tǒng)的理論和實踐［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2004:78.