李盈蕾， 陳建華， 宋曉凱， 孫吉佑， 詹永成， 吳同巖

(1.淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港222005;2.江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港222005)

大米草(Spartina anglica)是美國(guó)互花米草與歐洲米草的雜交種，我國(guó)于1963年成功引進(jìn)，具有耐鹽堿、耐淹、根系發(fā)達(dá)等特點(diǎn)，它可以起到保灘護(hù)岸、促淤造陸的重要作用，曾被稱(chēng)為“先鋒植物”。不過(guò)，大米草的迅速蔓延，造成了生態(tài)失衡、航道阻塞，讓人類(lèi)無(wú)法控制，它所引發(fā)的生態(tài)危害已經(jīng)成了一個(gè)世界性的難題［1－2］。利用大米草的豐富資源，變害為寶，是對(duì)其生態(tài)防控的有效辦法。已有文獻(xiàn)報(bào)道，其同屬植物互花米草總黃酮類(lèi)化合物具有降血脂等心血管方面的作用［3］，黃酮類(lèi)化合物同樣是大米草的活性成分之一［4］，本實(shí)驗(yàn)主要研究大米草總黃酮的提取工藝條件及其體外抗氧化活性。

1 儀器與材料

XH－100B 電腦微波催化合成∕萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司);UV－160A紫外－可見(jiàn)分光光度儀(日本島津);SHZ－D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);HWSY電熱恒溫水浴鍋(浙江舟山市定海區(qū)還遠(yuǎn)儀器廠(chǎng));JB/T 5374－1991電子天平(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司)。RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng));真空冷凍干燥機(jī)Genesis 2000 QS(美國(guó)VIRTIS)。

大米草(2008年5月采于連云港燕尾鎮(zhèn)沿海灘涂);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):10080－200306，中國(guó)藥品生物研究所);DPPH(批號(hào):20090112，美國(guó)SIGMA公司);其它試劑均為分析純。

2 提取與純化

2.1 大米草總黃酮的測(cè)定［5］

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定 精密稱(chēng)取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用無(wú)水乙醇溶解并定容于50 mL量瓶中，得0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密吸取 0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL比色管中，加無(wú)水乙醇至5 mL，加入 5%NaNO20.3 mL，搖勻放置 6 min，再加入 10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，搖勻放置 6 min，最后加 1 mol/L NaOH 4 mL，用無(wú)水乙醇溶液補(bǔ)至刻度，搖勻放置10 min后，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)比，在510 nm處測(cè)定其吸光值，吸光值(A)與為溶液濃度(C)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為A=10.993C+0.001 1，R=0.999 3。結(jié)果表明，蘆丁在8～40 μg/mL與吸光度線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.2 大米草總黃酮的提取工藝流程 稱(chēng)取大米草干品5 g→粉碎→過(guò)20目篩→乙醇溶液浸泡8 h→微波萃取→抽濾→真空濃縮→乙醇定容于100 mL量瓶→大米草提取液待測(cè)液。

2.1.3 樣品總黃酮含量及提取率的測(cè)定 精密吸取大米草待測(cè)液1 mL，按照2.1.1項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度，按照回歸方程計(jì)算提取液中的總黃酮含量。按提取率=藥材中總黃酮質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%，計(jì)算總黃酮提取率。

2.2 微波提取條件的優(yōu)化

微波法萃取植物總黃酮影響因素主要為:微波輻射量、所用的溶劑以及溶劑分?jǐn)?shù)、用量、浸泡時(shí)間，萃取溫度及萃取時(shí)間等［6］。本研究中固定浸泡時(shí)間為8 h，因此主要討論微波輻射量、乙醇的體積分?jǐn)?shù)、萃取時(shí)間和溶劑用量對(duì)提取率的影響。

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的單因素考察 精密稱(chēng)取4份5 g大米草樣品，分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%的乙醇溶液，固定其它因素，按2.1.2項(xiàng)下操作，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增高，50% ～70%之間提取率升高幅度較大，故可在此區(qū)間考查乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

2.2.2 微波萃取時(shí)間的單因素考察 精密稱(chēng)取5份5 g大米草樣品，微波萃取，時(shí)間分別為 1、3、6、10、15 min，固定其它因素，按2.1.2項(xiàng)下操作，結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，微波萃取時(shí)間在6～10 min之間提取率變化較大，在10 min達(dá)到最大值，然后提取率再次下降，可能是因?yàn)闀r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，黃酮易于分解，且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溫度過(guò)高，使細(xì)胞內(nèi)蛋白凝固，黃酮不易溶出［7］。因此本試驗(yàn)對(duì)于提取時(shí)間主要考察3～10 min內(nèi)的影響。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2.3 固液比的單因素考察 精密稱(chēng)取4份5 g大米草樣品，分別按固液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 加入提取溶劑，浸泡8 h，固定其它因素，微波萃取，按2.1.2項(xiàng)操作，結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)，固液比在1∶40后變化不大，考慮到提取效果和減少溶劑用量等方面，將固液比定在1∶20～1∶40之間較合適。

圖3 物料比對(duì)提取率的影響

2.2.4 萃取溫度的單因素考察 鑒于2.2.2項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)的萃取時(shí)間選在10 min內(nèi)，此時(shí)間內(nèi)微波萃取儀達(dá)不到要考察的溫度。故萃取溫度不作為考察因素。

2.3 微波提取工藝的優(yōu)化－正交試驗(yàn)

在微波提取的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇影響大米草總黃酮提取的主要因素提取時(shí)間(A)、微波功率(B)、溶劑濃度(C)、固液比(D)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，見(jiàn)表1，以提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)微波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 因素水平

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 方差分析

由表2及表3可知，影響大米草中總黃酮提取因素的主次順序?yàn)?D＞B＞C＞A;即固液比＞反應(yīng)功率＞溶劑濃度＞反應(yīng)時(shí)間。通過(guò)結(jié)果分析，正交實(shí)驗(yàn)的最佳工藝為A2B1C3D3。即使用濃度為70%的乙醇，固液比為1∶40，在功率為400 W的條件下提取6 min效果最佳。

2.4 最佳提取工藝的驗(yàn)證

取3份5 g大米草研碎，加入200 mL體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液，浸泡8 h后，微波萃取功率為400 W，萃取6 min。結(jié)果見(jiàn)表4。最佳提取工藝的平均提取率為0.462%。比各組試驗(yàn)提取率均高。

表4 最佳工藝重復(fù)實(shí)驗(yàn)

2.5 大米草總黃酮的純化

取大米草總黃酮提取液，利用AB－8大孔樹(shù)脂純化，大孔樹(shù)脂的預(yù)處理及洗脫條件按文獻(xiàn)［8］操作，采用乙醇梯度洗脫，將20% ～40%乙醇洗脫液610 mL合并，濃縮、于培養(yǎng)皿中在低溫冰箱中冷凍，凝固后于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，以用于進(jìn)一步定性檢測(cè)及活性測(cè)定。冷凍干燥后得粉末狀粗大米草總黃酮。

3 抗氧化活性研究

3.1 大米草粗總黃酮定性驗(yàn)證

取大米草粗總黃酮粉末0.5 g，蒸餾水定容于25 mL量瓶中，吸取2 mL，分別滴加Al(NO3)3溶液和鎂粉與濃鹽酸數(shù)滴，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 大米草總黃酮定性反應(yīng)

從表5的結(jié)論可以看出，該反應(yīng)屬于黃酮類(lèi)化合物的特征顏色反應(yīng)，說(shuō)明此溶液中主要成分為黃酮類(lèi)化合物。

3.2 體外抗氧化活性研究

3.2.1 大米草粗總黃酮對(duì)DPPH·自由基的清除作用 采用郭雪峰［9］的方法測(cè)定，取各濃度的大米草粗總黃酮溶液1 mL與257.7 mg/L DPPH 95%乙醇溶液(樣品對(duì)照為大米草粗總黃酮溶液1 mL與95%乙醇，DPPH對(duì)照為4 mL DPPH溶液與1 mL 95%乙醇溶液)于10 mL比色管中，振蕩，混勻，反應(yīng)40 min后，用95%乙醇作參比對(duì)照，利用紫外分光光度計(jì)在518.4 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定結(jié)果分別記為As、Ar、Ao。陽(yáng)性對(duì)照藥Vc同法操作。結(jié)果見(jiàn)表6。清除率Y%=［1－(As－Ar)/Ao］×100%。

表6 清除DPPH·

取大米草粗總黃酮溶液濃度與抑制率Y做線(xiàn)性回歸，得Y=852.65X+4.6096，r=0.9847。根據(jù)線(xiàn)性方程得出大米草粗總黃酮清除DPPH·自由基的IC50為0.053 2 mg/mL。大米草粗總黃酮與陽(yáng)性藥Vc的抑制率相同時(shí)，根據(jù)回歸方程計(jì)算大米草粗總黃酮當(dāng)量濃度為0.051 7 mg/mL，同等清除能力所需用量約為陽(yáng)性藥Vc的5.17倍。

3.2.2 大米草粗總黃酮對(duì)羥自由基的清除能力 利用Fenton體系產(chǎn)生·OH［10］，向 Fenton 試劑中加入 Tris－HCl緩沖溶液、鄰二氮菲試劑、不同濃度的大米草粗總黃酮溶液(空白只加Tris－HCl緩沖溶液，樣品對(duì)照加Tris－HCl緩沖溶液和不同濃度的大米草粗總黃酮溶液，反應(yīng)對(duì)照不加大米草粗總黃酮溶液，以及不加入H2O2不形成Fenton體系的陰性反應(yīng)對(duì)照)于10 mL比色管中，振蕩，混勻。置入恒溫水浴鍋中，37℃下水浴1 h。利用空白對(duì)照，紫外分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)定吸光度，分別記為 A樣、A提、A損、A未損。陽(yáng)性對(duì)照藥 Vc同法操作，結(jié)果見(jiàn)表7。清除率Y%=［(A樣－A提)－A損/A未損－A損］×100%。

表7 清除·OH

取大米草粗總黃酮溶液濃度對(duì)抑制率Y做線(xiàn)性回歸，得Y=209.56X－48.71，r=0.986 8。根據(jù)線(xiàn)性方程，得出大米草粗總黃酮清除·OH的IC50為0.471 0 mg/mL。大米草粗總黃酮與陽(yáng)性藥Vc的抑制率相同時(shí)，根據(jù)回歸方程計(jì)算大米草粗總黃酮當(dāng)量濃度為0.352 5 mg/mL，同等清除能力用量約為陽(yáng)性藥Vc的3.5倍。

4 討論

4.1 試驗(yàn)結(jié)果表明，微波法提取大米草總黃酮最佳工藝為:70%的乙醇，固液比為1∶40，在功率為400 W的條件下提取6 min。方法簡(jiǎn)便，快捷，節(jié)能?？勺鲞M(jìn)一步中試試驗(yàn)及擴(kuò)大化操作。

4.2 ·OH是機(jī)體內(nèi)氧化性最強(qiáng)的自由基，可促使機(jī)體肝、腦、腎組織以及腦線(xiàn)粒體脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷［11］。大米草粗總黃酮清除·OH的能力較清除DPPH·的能力更強(qiáng)。可作為天然抗氧化劑做進(jìn)一步研究。

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