王緒穎， 賈曉斌， 陳 彥

(1.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥新型給藥系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇南京210028;2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

延胡索為罌粟科植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥塊莖，主產(chǎn)地浙江，為著名的浙八味之一，具有活血化瘀、理氣止痛功效。現(xiàn)代藥理研究表明延胡索中主要有效組分延胡索總生物堿具有鎮(zhèn)痛、抗?jié)?、抑制胃酸分泌、解痙及增加冠脈血流量，抗心律失常等作用［1］，總生物堿中延胡索乙素的鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)［2］。文獻(xiàn)中提取純化延胡索總生物堿，通常以延胡索乙素或總生物堿為指標(biāo)［3－6］，而同時(shí)以延胡索乙素和延胡索總生物堿為指標(biāo)的則未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以延胡索乙素和總生物堿的含量為指標(biāo)，以正交試驗(yàn)優(yōu)選延胡索總生物堿的乙醇回流提取方法，以延胡索乙素和延胡索總生物堿的比吸附量和比洗脫量為指標(biāo)篩選出最佳純化樹(shù)脂，并考察其純化延胡索乙醇提取液的工藝條件及參數(shù)，為延胡索總生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)提供切實(shí)的理論依據(jù)和條件。

1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀;十萬(wàn)分之一電子天平(METTLER TOLEOR公司);UV－2802型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海尤尼克儀器有限公司);DZF－6051真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);DK－S26型恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

樹(shù)脂購(gòu)自上海摩速科學(xué)器材有限公司;延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào):0726－200208，供含量測(cè)定用，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供);醋延胡索(批號(hào):080201，南京藥業(yè)股份有限公司中藥飲片廠)，經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽(yáng)臻教授鑒定為罌粟科延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的醋制品;甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 延胡索乙素含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱Agilent HC－C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相MeOH－0.1%H3PO4(三乙胺調(diào)節(jié) pH=6)57 ∶43;流量:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。理論板數(shù)以延胡索乙素計(jì)不低于5 000，延胡索乙素色譜峰與相鄰未知色譜峰的分離度＞1.5，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取延胡索乙素對(duì)照品3.42 mg至10 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含延胡索乙素0.342 mg的對(duì)照品貯備液;分別精密吸取貯備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL 至 5 mL 量瓶，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻;分別精密吸取上述對(duì)照品溶液20 μL進(jìn)樣，測(cè)得峰面積積分值。以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=45.674X+27.791，r=0.999 9，結(jié)果表明，延胡索乙素進(jìn)樣量在0.136 8～1.368 μg與峰面積有良好的線性關(guān)系。

圖1 延胡索乙素對(duì)照品(A)與樣品(B)HPLC色譜圖，1為延胡索乙素

2.1.3 樣品的含量測(cè)定 吸取適量提取液或樹(shù)脂沖出液水浴揮干，用甲醇定容至5 mL，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，精密吸取20 μL進(jìn)樣，計(jì)算其含量。

2.2 延胡索總生物堿含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取延胡索乙素對(duì)照品2.22 mg至10 mL量瓶中，用pH4.5的乙酸－醋酸鈉緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含延胡索乙素0.222 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 顯色方法及檢測(cè)波長(zhǎng)的確定［7］精密吸取對(duì)照品溶液0.3 mL，至預(yù)先精密加入氯仿10 mL的分液漏斗中，再加0.7 mL pH4.5的醋酸－醋酸鈉緩沖液，精密加入4 mL溴甲酚綠溶液，振搖3 min，靜置40 min，分取氯仿層，用UV－2802型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在414 nm處有最大吸收峰，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為414 nm。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對(duì)照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置預(yù)先精密加入氯仿10 mL的分液漏斗中，再分別加1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mL pH4.5 的醋酸－醋酸鈉緩沖液，精密加入4 mL溴甲酚綠溶液，振搖3 min，靜置40 min，分取氯仿層，在414 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品溶液的體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=60.798X－0.003 4，r=0.999 3，表明對(duì)照品濃度在0.002 22～0.011 1 mg/mL與吸光度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 樣品的含量測(cè)定 取適量提取液或樹(shù)脂沖出液水浴揮干，用pH4.5的醋酸－醋酸鈉緩沖液定容至5 mL量瓶中，精密吸取1mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下同法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算其含量。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)選延胡索的乙醇提取工藝

延胡索具有鎮(zhèn)痛止痛等功效，其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)生物堿類組分易溶于乙醇和酸水中，經(jīng)過(guò)醋制后生物堿成鹽又能溶于水中，所以提取溶劑選擇含水乙醇。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)一步考察乙醇回流提取工藝，根據(jù)延胡索總生物堿的性質(zhì)，以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇為提取溶劑，進(jìn)行平行性試驗(yàn)，分別測(cè)定提取液中延胡索乙素和總生物堿的含量(mg/g生藥)，試驗(yàn)結(jié)果延胡素乙素含量分別為:0.115、0.232、0.419、0.308、0.197 mg/g生藥，總生物堿含量分別為:1.924、3.437、7.654、4.502、2.585 mg/g生藥，所以選擇30%、50%、70%乙醇作為正交試驗(yàn)因素乙醇濃度的三個(gè)水平。對(duì)影響乙醇回流提取的主要影響因素:乙醇濃度、溶劑用量、回流提取時(shí)間和提取次數(shù)按四因素三水平表L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，各因素水平見(jiàn)表1，按正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，平行2次，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表4，并對(duì)延胡索乙素和總生物堿的含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3、表5。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.3.1 正交試驗(yàn)樣品制備 分別精密稱取9份延胡索藥材，每份100 g，按正交試驗(yàn)表各行各列條件制備樣品提取液，按含量測(cè)定項(xiàng)下制備樣品溶液。

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 以延胡索乙素含量為考察指標(biāo)，由表2直觀分析表明影響延胡索乙素含量的主要因素為A，次要因素為D、C、B，方差分析表明A、D因素對(duì)延胡索乙素的含量有顯著意義(P＜0.01)，B、C因素?zé)o顯著意義，最佳組合為A2B3C3D3。以延胡索總生物堿含量為考察指標(biāo)，表4直觀分析表明影響延胡索總生物堿含量的主要因素為A，次要因素為D、C、B，方差分析表明A因素對(duì)延胡索總生物堿的含量有顯著意義(P＜0.01)，B、C、D因素?zé)o顯著意義，最佳組合為A2B2C2D3。

不同考察指標(biāo)下A、D的最佳條件為A2D3，B、C有差別，方差分析表明B、C無(wú)顯著意義，綜合生產(chǎn)實(shí)際，選擇B2C2，確定工藝條件為A2B2C2D3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果1(延胡索乙素含量指標(biāo)n=2)

表3 延胡索乙素含量方差分析

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果2(延胡索總生物堿含量指標(biāo)n=2)

表5 延胡索總生物堿含量方差分析

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，取3份藥材，每份1 000 g，用6倍量50%乙醇，加熱回流提取3次，每次2 h，然后分別測(cè)定各樣品中延胡索乙素和總生物堿含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 延胡索總生物堿純化工藝研究

延胡索生藥經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳工藝提取后總生物堿的轉(zhuǎn)移率達(dá)85.6%，但得到的浸膏不容易干燥成粉，可能含較多水溶性多糖、果膠、黏液質(zhì)及醇溶性油脂等，不利于制劑成型以及質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)以延胡索總生物堿和延胡索乙素含量為指標(biāo)，用大孔吸附樹(shù)脂法對(duì)延胡索乙醇提取物進(jìn)一步純化，篩選出延胡索生物堿的大孔樹(shù)脂分離富集工藝條件，為下一步制劑成型奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

2.4.1 樣品制備 延胡索用6倍量50%乙醇，回流提取3次，每次2 h，合并濾液濃縮至1 g/mL，測(cè)得延胡索乙素含量為0.447 mg/g，延胡索總生物堿含量為8.212 mg/g。

2.4.2 樹(shù)脂預(yù)處理 先用2 mol/L NaOH浸泡5 h，用蒸餾水洗至中性。再用3 mol/L鹽酸浸泡8 h，用蒸餾水洗至中性。最后用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，用95%乙醇洗至流出液加5倍水無(wú)白色渾濁，再用蒸餾水反復(fù)清洗至無(wú)醇?xì)馕?，用蒸餾水浸泡后待用。

2.4.3 樹(shù)脂型號(hào)確定 采用動(dòng)態(tài)吸附法，比較四種樹(shù)脂對(duì)延胡索乙素和總生物堿的比吸附量、比洗脫量，優(yōu)選出最佳樹(shù)脂。

稱取處理好的 AB－8、D101、HPD600 和 X－5 四種型號(hào)的濕樹(shù)脂各5.00 g，濕法裝柱，上樣53.00 mL，平行上樣3份，調(diào)節(jié)流速為0.5 mL/min，過(guò)柱流出液重吸附2次，靜置4 h，用蒸餾水洗至流出液無(wú)色，以70%乙醇洗脫10倍柱體積，分別用HPLC法和UV法測(cè)定流出液中延胡索乙素和總生物堿的含量，并分別計(jì)算比吸附量、比洗脫量，結(jié)果見(jiàn)表7、表8。

表7 4種型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)延胡索乙素的動(dòng)態(tài)吸附性能比較(n=3)

表8 4種型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)延胡索總生物堿的動(dòng)態(tài)吸附性能比較(n=3)

由表7可知，樹(shù)脂AB－8對(duì)延胡索乙素的比吸附量為11.605 mg/g，10 BV70%乙醇比洗脫量為9.246 mg/g，均為4種樹(shù)脂中最大，折合生藥量每克干樹(shù)脂吸附25.962 g生藥。由表8可知，樹(shù)脂AB－8對(duì)延胡索總生物堿的比吸附量為68.047 mg/g，10BV70%乙醇比洗脫量為42.284 mg/g，均為4種樹(shù)脂中最大，折合生藥量每克干樹(shù)脂吸附8.286 g生藥。

不同考察指標(biāo)下均篩選出AB－8為最佳樹(shù)脂，但不同考察指標(biāo)下樹(shù)脂對(duì)生藥的比吸附量不同，其中延胡索乙素折合生藥的樹(shù)脂比吸附量遠(yuǎn)大于延胡索總生物堿折合生藥的樹(shù)脂比吸附量，為盡量保留有效組分，選擇以延胡索總生物堿為指標(biāo)下的飽和吸附量作為生藥的最佳吸附量，即8.286 g/g。

2.4.4 水洗體積確定 按延胡索總生物堿的飽和吸附量上樣，精密吸取樣品液(1 g/mL)8.29 mL加至已處理好的裝有5 g濕AB－8大孔吸附樹(shù)脂柱，調(diào)節(jié)流速為0.5 mL/min，過(guò)柱流出液重吸附2次，靜置4 h，用蒸餾水洗脫，每1 BV收集在一起，分別用Molish反應(yīng)檢測(cè)，第6 BVMolish反應(yīng)陰性，證明不吸附的雜質(zhì)已基本洗脫完全，確定上柱后水洗體積為6 BV。

2.4.5 洗脫溶劑濃度確定 按延胡索總生物堿的飽和吸附量上樣，精密吸取樣品液(1 g/mL)8.29 mL加至已處理好的裝有5 g濕AB－8大孔吸附樹(shù)脂柱，調(diào)節(jié)流速為0.5 mL/min，過(guò)柱流出液重吸附2次，靜置4 h，用蒸餾水洗脫至流出液無(wú)色，依次用40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇各10 BV洗脫，洗脫液流速為1.0 mL/min，測(cè)定洗脫液中延胡索乙素和總生物堿的量并分別計(jì)算洗脫百分率，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 洗脫溶劑濃度的確定

由表9可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，AB－8樹(shù)脂對(duì)延胡索乙素和延胡索總生物堿的累積洗脫率逐漸增大，但90%乙醇洗脫的量增加的很少，綜合生產(chǎn)實(shí)際選擇80%乙醇作為洗脫溶劑。

2.4.6 洗脫溶劑體積確定 按延胡索總生物堿的飽和吸附量上樣，精密吸取樣品液(1 g/mL)8.29 mL加至已處理好的裝有5 g濕AB－8大孔吸附樹(shù)脂柱，調(diào)節(jié)流速為0.5 mL/min，過(guò)柱流出液重吸附2次，靜置4 h，用蒸餾水洗脫6倍柱體積，用80%乙醇洗脫，按 1 BV、2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV、7 BV、8 BV、9 BV、10 BV、11 BV、12 BV、13 BV、14 BV、15 BV、16 BV進(jìn)行收集，繪制洗脫曲線。分別測(cè)定延胡索乙素和總生物堿的含量，并分別以延胡索乙素和總生物堿的比洗脫量為縱坐標(biāo)(mg/g)，洗脫柱體積(BV)為橫坐標(biāo)繪制延胡索乙素和總生物堿的洗脫曲線，見(jiàn)圖2。

由圖2可知，第11 BV80%的乙醇已經(jīng)基本洗脫不到延胡索乙素和總生物堿，所以選擇10 BV作為洗脫溶劑的最佳洗脫體積。

2.4.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，吸取82.86 mL樣品液，按上述確定的最佳工藝條件，加至已處理好的裝有50 g濕AB－8大孔吸附樹(shù)脂柱，調(diào)節(jié)流速為0.5 mL/min，過(guò)柱流出液重吸附2次，靜置2 h，用蒸餾水洗脫6倍柱體積，用80%乙醇洗脫10 BV，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，80℃真空干燥。測(cè)定延胡索乙素和延胡索總生物堿含量及各自占干膏的比例。結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

圖2 80%乙醇洗脫曲線，A為延胡索乙素指標(biāo)，B為延胡索總生物堿指標(biāo)

3 結(jié)論與討論

乙醇回流提取延胡索的最佳工藝條件是6倍量50%乙醇，加熱回流提取3次，每次2 h;AB－8樹(shù)脂純化延胡索乙醇提取液的最佳工藝條件是每克干樹(shù)脂吸附8.286 g生藥，上柱后水洗6 BV，80%乙醇洗脫10 BV。該工藝經(jīng)驗(yàn)證，總生物堿的提取轉(zhuǎn)移率達(dá)85.6%，純化轉(zhuǎn)移率達(dá)77.95%，終產(chǎn)品總生物堿純度為54.25%，該工藝穩(wěn)定可靠，可較好的提取純化延胡索中總生物堿。

在篩選上柱液最佳pH的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)將上柱液pH調(diào)為堿性時(shí)有沉淀析出，且堿性越強(qiáng)，產(chǎn)生沉淀越多，易堵塞樹(shù)脂柱，不利于樹(shù)脂柱的吸附。pH調(diào)為酸性時(shí)雖然比吸附量增大，但比洗脫量下降，而因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所用的延胡索為醋制，上柱原液pH為5.20，比吸附量和比洗脫量都較大，所以上柱液最佳pH確定為原液pH。

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