許文博， 王玉蓉*， 黃能聽(tīng)， 趙韶華， 張玉杰

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100102;2.河北以嶺醫(yī)藥集團(tuán)，河北石家莊050035)

全蝎(Buthus martensii Karsch)系鉗蝎科節(jié)肢動(dòng)物干燥物，性平，味辛，有毒，歸肝經(jīng)。具有通絡(luò)止痛、熄風(fēng)止痙作用?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明全蝎提取液具有抗凝和抗血栓等作用［1－2］。為進(jìn)一步研究全蝎的抗凝活性部分的工藝［3］，本實(shí)驗(yàn)以APTT法、纖維蛋白原平板法為考察指標(biāo)，對(duì)仿生酶解法、復(fù)合酶解法、水提醇沉法、生理鹽水浸提法等提取方法的效果進(jìn)行比較，以證明仿生酶解法工藝的可行性。

1 材料

1.1 藥材

全蝎為全蟲(chóng)干燥體，由河北以嶺藥業(yè)集團(tuán)提供，經(jīng)本校陳玉婷教授鑒定系鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch)的干燥體，置于60℃干燥箱干燥，粉碎成細(xì)粉，備用。

1.2 試劑

牛血清白蛋白(BSA，Sigma A7906，北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司);牛纖維蛋白原(Sigma F8630，北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司);胰蛋白酶1∶250(Amresco0458，北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司);胃蛋白酶1∶10 000(Sigma P7000，北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司);醫(yī)用注射性尿激酶(北京市望京醫(yī)院);凝血酶(Sigma T4648，北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司);APTT試劑10×1.5 mL(上海太陽(yáng)生物試劑公司);Protein Assay Dye Rgnt(Bio－red 5000006;北京澤平科技有限責(zé)任公司);三氯乙酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙醇(分析純)。

生理鹽水(稱取氯化鈉9 g，加蒸餾水定容至1000 mL，搖勻，即得);人工胃液(取鹽酸9 mL，加蒸餾水稀釋成1000 mL，即得);人工腸液(取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 mL，加0.2 mol/L氫氧化鈉溶液118 mL，用水稀釋至1000 mL，搖勻，即得)。

1.3 動(dòng)物

健康日本大耳白兔(♂性)，體重約2 kg(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，符合國(guó)家健康一級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物許可證編號(hào)為:SCXK(京)2006－0009。

1.4 儀器

UV－2000型分光光度計(jì);800B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);ES－120型電子分析天平(長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司);恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠);DZ－1BC型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法

2.1 仿生酶解法

在采用紫外分光光度法研究酶解工藝基礎(chǔ)上［4］，繼以蛋白質(zhì)水解度為指標(biāo)，單因素考察全蝎仿生酶解的工藝條件。

2.1.1 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定［5］

2.1.1.1 試劑的配制 染色液的配制:準(zhǔn)確量取Bio－Rad Protein Assay 50 mL，加入蒸餾水稀釋定容至250 mL，濾去不溶性物質(zhì)即得，置室溫下可保存6個(gè)月。

牛血清白蛋白(BSA)1 mg/mL的配制:準(zhǔn)確稱取10 mg BSA，蒸餾水定容于10 mL，其濃度為1 mg/mL(1 000 mg/L)，置冰箱保存。

2.1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以1 mg/mL BSA為母液給各個(gè)試管分別加入 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，用蒸餾水補(bǔ)充至0.1 mL，以上每種濃度平行操作兩份，最后各試管中分別加入5.0 mL考馬斯亮蘭G－250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合。2 min至1 h之內(nèi)(室溫下)于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定各管吸光度值A(chǔ)595nm，兩個(gè)平行樣品取其平均值?？瞻讓?duì)照為0.1 mL蒸餾水加5 mLG－250試劑。以吸光度值A(chǔ)595nm為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度BSA為橫坐標(biāo)，作圖即繪出測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性方程y=0.994 7x+0.023 8(r=0.998 6)。結(jié)果表明，BSA在0～1 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.1.3 供試品的制備方法 取2 g全蝎藥材細(xì)粉于50 mL具塞圓底燒瓶中，加入40 mL人工胃液，密閉，于37℃恒溫水浴作用30 min后，加入一定量胃蛋白酶水解一定時(shí)間后，將酶解液置于85℃恒溫水浴作用15 min，得樣品1，沉淀備用;取200 μL的樣品1和等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的TCA溶液，冷卻至室溫，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，為樣品2;上述備用沉淀于50 mL具塞圓底燒瓶中，繼加入20倍量人工腸液，密閉，于適宜恒溫水浴作用30 min后，加入若干胰蛋白酶水解一定時(shí)間，將酶解液于85℃恒溫水浴作用15 min，得樣品3;與樣品2同法制得樣品4。

2.1.1.4 水解度的計(jì)算方法［6］

式中:N2為藥材酶解液加入20%TCA后測(cè)得的可溶性蛋白量(g/L)，即樣品2及樣品4;N1為藥材酶解前加入20%TCA測(cè)得的可溶性蛋白量(g/L)—1 g藥材細(xì)粉加入10 mL 20%TCA，過(guò)濾，所得上清液;N0為不同酶解工藝提取總蛋白量(g/L)，即樣品1或樣品3。

經(jīng)篩選確定全蝎的最優(yōu)酶解工藝為:全蝎藥材細(xì)粉加入人工胃液(固液比1∶20)，密閉，于37℃恒溫水浴作用30 min后，加入3.0%胃蛋白酶水解3 h，將酶解液置于85℃恒溫水浴作用15 min，冷卻至室溫，以4 200 r/min離心15 min，取上清液，干燥得全蝎胃蛋白酶酶解物;沉淀干燥，繼加入20倍量人工腸液，密閉，于37℃恒溫水浴作用30 min后，加入5%胰蛋白酶水解4 h，將酶解液于85℃恒溫水浴作用15 min，冷卻至室溫，以4 200 r/min離心15 min，取上清液，干燥得全蝎胰蛋白酶酶解物。

2.2 水提醇沉法［7］

稱取2 g全蝎藥材細(xì)粉于50 mL圓底燒瓶，加入8倍量蒸餾水，煎煮1 h，紗布濾出煎煮液;藥渣再加6倍量蒸餾水，煎煮2次，每次30 min，合并3次濾出液，水浴濃縮至藥液比為1∶1，攪拌加入95%乙醇至含醇量為70%，置冰箱中放置過(guò)夜后4 200 r/min離心20 min，取上清液揮干，60℃真空干燥稱重，得全蝎水提醇沉物。

2.3 生理鹽水浸提法

稱取2 g全蝎藥材細(xì)粉于50 mL圓底燒瓶，加入40 mL生理鹽水，于37℃恒溫水浴鍋浸提4 h，4 200 r/min離心15 min，取上清液，60℃真空干燥稱重，得全蝎生理鹽水浸提物。

2.4 復(fù)合酶解法［7］

稱取2 g全蝎藥材細(xì)粉于50 mL圓底燒瓶，加入40 mL人工胃液，密閉，于37℃水浴作用30 min后，加入60 mg胃蛋白酶水解，3 h后用1 mol/mL NaOH溶液調(diào)節(jié)酶解液的pH=6.8，加入100 mg胰蛋白酶酶解4 h，于85℃水浴滅酶15 min，4 200 r/min離心15 min，取上清液，60℃真空干燥稱重，得干燥復(fù)合酶解物。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 樣品液的制備

精密稱取各種提取方法所得提取物適量，加入320 μL生理鹽水，制成濃度為250 mg(生藥量)/320 μL的樣品(即0.781 3 mg/μL)。

3.2 APTT 法［8］

3.2.1 血漿的制備 選用♂性日本大耳白兔，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉，頸動(dòng)脈取血，加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，混勻后以3 000 r/min，離心 15 min，取上清液，分離出貧血小板血漿(PPP)。

3.2.2 測(cè)定步驟 在測(cè)試槽中，將已預(yù)溫10 min的APTT試劑100 μL，與預(yù)溫5 min的待測(cè)血漿(100 μL PPP 加樣品液10 μL)混合，孵育5 min后加入預(yù)溫37℃的 CaCl2100 μL，同時(shí)計(jì)時(shí)，用針尖撥動(dòng)溶液，當(dāng)有絲狀凝結(jié)物被針挑起時(shí)，記錄時(shí)間。

空白對(duì)照組:按上述方法取 PPP 100 μL，加入10 μL生理鹽水和100 μL APTT試劑，孵育5 min后加入預(yù)溫37℃的CaCl2100 μL，同時(shí)計(jì)時(shí)，記錄凝結(jié)時(shí)間。每個(gè)樣品平行做6份。結(jié)果見(jiàn)表1。圖1。

表1 全蝎4種提取方法APTT抗凝藥效考察(±s，n=6)

表1 全蝎4種提取方法APTT抗凝藥效考察(±s，n=6)

與生理鹽水組比較，*P＜0.05。

/s水提醇沉組樣品名稱 濃度/(mg/μL) 凝血時(shí)間0.781 3 35.62±3.55生理鹽水浸提 0.781 3 46.92±5.13*復(fù)合酶解組 0.781 3 46.08±2.17*仿生酶解胃酶酶解部分 0.781 3 ＞300.00*仿生酶解胃酶酶解部分(低濃度) 0.390 6 70.02±5.06*仿生酶解組胰酶酶解部分 0.781 3 95.73±7.05*生理鹽水組 0 25.52±1.09人工胃液組0 31.70±1.07

通過(guò)全蝎4種提取物的抗凝實(shí)驗(yàn)效果比較，結(jié)果表明酶解組優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑提取組，其中仿生酶解組抗凝效果最優(yōu)，證明仿生酶解法基本可行，見(jiàn)圖1。

圖1 全蝎4種提取方法APTT抗凝藥效考察

3.3 纖維蛋白原平板法［9］

纖維蛋白原在凝血酶加入后形成了凝固的纖維蛋白平板。當(dāng)加入含有纖溶酶原激活劑的樣品后，纖溶酶原激活劑激活平板中的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，纖溶酶再水解纖維蛋白。從而在凝固的纖維蛋白中形成液狀的溶解圈。另外，尚存有不依賴?yán)w溶酶系統(tǒng)的纖溶作用。如木瓜蛋白酶、糜蛋白酶等可不通過(guò)激活纖溶酶而降解纖維蛋白(原)。

3.3.1 試液的配制 磷酸緩沖液(PBS):稱取3.12 g磷酸二氫鈉，加蒸餾水定容到100 mL，即得A液;稱取磷酸氫二鈉7.163 2 g，加蒸餾水定容到100 mL，即得B液;使用時(shí)，取A 液760 μL、B 液3 240 μL加入76 mL生理鹽水，即得磷酸緩沖液。

纖維蛋白原溶液:稱取纖維蛋白原0.3 g加入60 mL PBS，振搖，溶解，即得。

3.3.2 纖維蛋白平板的制備 在平皿內(nèi)加入9 mL 5 g/L的纖維蛋白原溶液，再加入2×103U/L的凝血酶溶液1 mL，立即打旋混勻大約10 s，即形成1 mm厚的纖維蛋白凝塊，在平皿上蓋加濾紙，在水平處放4 h后即形成纖維蛋白平板。

3.3.3 測(cè)定步驟 將樣品液、尿激酶(6×105U/L)和生理鹽水各10 μL分別點(diǎn)在纖維蛋白平板上，各點(diǎn)間距大于1.5 cm。置纖維蛋白平板于濕盒內(nèi)，放入37℃烘箱中，4 h后觀察有無(wú)溶解圈，并測(cè)量溶解圈的直徑，計(jì)算溶解圈面積，以溶解圈面積大小衡量纖溶活性的大小。見(jiàn)表2和圖2。

溶解圈面積(mm2)=［(長(zhǎng)徑+短徑)/4］2×π。

表2 全蝎各種提取方法纖維蛋白平板溶栓實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=4)

圖2 全蝎提取方法的藥效考察

從圖2可以看出，全蝎酶解法優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法，其中仿生酶解法所得的胃酶酶解部分和胰酶酶解部分有明顯溶解圈，進(jìn)一步證明仿生酶解法可行。

4 小結(jié)與討論

4.1 APTT試驗(yàn)結(jié)果表明

全蝎的各種提取方法所得提取物均能在一定程度上延長(zhǎng)APTT凝血時(shí)間，其中仿生酶解法胃酶酶解部分和胰酶酶解部分APTT凝血時(shí)間最長(zhǎng)，故認(rèn)為仿生酶解法基本可行。

4.2 纖維蛋白原平板試驗(yàn)結(jié)果表明

仿生酶解法所得的胃酶酶解部分和胰酶酶解部分較其他提取物的溶解圈明顯增大，進(jìn)一步證明仿生酶解的工藝方案可行。推測(cè)其原因是:仿生酶解法模擬了動(dòng)物藥口服后體內(nèi)消化過(guò)程，將動(dòng)物體大分子蛋白經(jīng)胃腸環(huán)境降解為小分子物質(zhì)，使有效部分顯露其活性效應(yīng)。胃酶酶解原液部分還有活性，表明用胰蛋白酶進(jìn)一步酶解的必要性。

4.3 原文獻(xiàn)中，纖維蛋白原平板實(shí)驗(yàn)的溶解圈長(zhǎng)短徑多以鋼尺或游標(biāo)卡尺粗量，量化不十分準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)采用1000萬(wàn)長(zhǎng)焦數(shù)碼相機(jī)拍照，輔以作圖工具ipwin32測(cè)量，通過(guò)設(shè)立標(biāo)尺，以相對(duì)值進(jìn)行計(jì)算，提高了精確度。

4.4 本研究為全蝎采用仿生酶解后分離純化抗凝、抗血栓的活性部分奠定了基礎(chǔ)。

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