尹萬忠 王 蘋 祝 威 （吉林大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,長春 130021）

人喉癌長春新堿耐藥細胞株的建立及其生物學特性①

尹萬忠 王 蘋 祝 威 （吉林大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,長春 130021）

目的:建立人喉癌長春新堿多藥耐藥細胞系。方法:以藥物濃度梯度遞增法誘導篩選人喉癌Hep-2的多藥耐藥細胞株Hep-2/v,比較兩組細胞的形態(tài)和倍增時間;MTT法確定細胞的IC50及其耐藥指數(shù);流式細胞儀檢測兩組細胞的細胞周期分布以及細胞內(nèi)的羅丹明聚集情況;實時定量RT-PCR法檢測MDR1基因的mRNA表達,Western blot法檢測相應(yīng)的蛋白表達情況。結(jié)果:建成的Hep-2/v耐藥細胞株,其耐藥性能穩(wěn)定,耐藥指數(shù)為45,并與順鉑及5-氟尿嘧啶有不同程度的交叉耐藥性;Hep-2/v的體外群體細胞倍增時間較親代細胞延長13.58小時;細胞周期分析結(jié)果顯示其G0/G1期細胞升高,而S期細胞則明顯降低（P＜0.05）;羅丹明染色顯示,Hep-2細胞內(nèi)的羅丹明較Hep-2/v明顯升高（P＜0.01）;Hep-2/v細胞MDR1表達在基因及蛋白水平明顯高于Hep-2細胞（P＜0.01）。結(jié)論:Hep-2/v細胞株具有明確及穩(wěn)定的多藥耐藥性,是研究多藥耐藥機制及篩選逆轉(zhuǎn)劑的良好模型。

喉腫瘤;長春新堿;多藥耐藥

腫瘤的多藥耐藥性（Multidrug resistance,MDR）是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時,對結(jié)構(gòu)和作用機理完全不同的其它多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性,多藥耐藥性已成為化療失敗的重要原因之一,因此逆轉(zhuǎn)MDR成為腫瘤研究中的重要課題。而建立多藥耐藥細胞系是研究腫瘤多藥耐藥性的基礎(chǔ)。本實驗采用長春新堿,以藥物濃度梯度遞增法誘導建立人喉癌多藥耐藥細胞系,以進一步研究腫瘤的多藥耐藥性及逆轉(zhuǎn)治療。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人喉癌Hep-2細胞系由中國醫(yī)學科學院提供。

1.1.2 試劑 長春新堿（VCR）、順鉑（DDP）、二甲基四氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）及Rhodmine123購自Sigma公司;5-氟尿嘧啶（5-Fu）購自Lic公司;RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清及胰蛋白酶購自Invitrogen公司;MDR1抗體購自Chem icon公司;PVDF膜購自Millipore公司;實時熒光定量PCR試劑盒購自CapitalBio公司,實驗中所有引物均在Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人喉癌Hep-2細胞加入培養(yǎng)液為含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/m l的RPM I1640培養(yǎng)液中,置 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細胞多藥耐藥性的誘導 篩選藥物為VCR,以喉癌Hep-2細胞為親本細胞,采用藥物濃度梯度遞增法誘導篩選耐藥細胞。首先用MTT法測定VCR對喉癌親本細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.04 μmol/L。首次加藥濃度為0.02μmol/L VCR,待細胞穩(wěn)定生長并傳代后,逐步提高藥物的濃度,歷時12個月后,細胞可在0.96μmol/L濃度中穩(wěn)定生長。MTT法測定IC50為1.8μmol/L,誘導篩選的耐藥細胞株命名為Hep-2/v。

1.2.3 MTT法測定藥物的敏感性 選取對數(shù)生長期Hep-2及Hep-2/v細胞,調(diào)整密度為5×104m l-1,接種于96孔板,每孔100μl,再分別加入長春新堿、順鉑及5-氟尿嘧啶3種化療藥物,每孔總體積200 μl,每組細胞設(shè)5個倍比濃度梯度,一個空白對照,各種藥物濃度作3個平行孔,培育72小時后,每孔加入5mg/ml的MTT 20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4小時,每孔加200 μl DMSO,以490 nm檢測波長,測定各孔的光密度值（A 值）,計算IC50和RI:按抑制率=（1-加藥組A值/細胞對照組A值）×100%計算每一種濃度的抑制率,并根據(jù)直線回歸法計算各種抗癌藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）及耐藥指數(shù)（RI）,RI=IC50（耐藥細胞）/IC50（親本細胞）。

1.2.4 生長曲線的繪制、倍增時間測定及細胞形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期細胞,調(diào)整密度為 5×104m l-1,取2m l細胞懸液接種至24孔培養(yǎng)板,置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每日取3孔細胞計數(shù),計算均值,連續(xù)觀察7日,繪制生長曲線,按Patterson公式[1]計算群體倍增時間（Doub ling time,TD）,TD=T×log 2/（logNt-logNo）,No:初始細胞數(shù),Nt:終末細胞數(shù),T:Nt-No時間。倒置顯微鏡下觀察耐藥細胞和親本細胞的形態(tài)學變化。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期及細胞內(nèi)羅丹明的蓄積變化 取含1×106m l-1細胞的單細胞懸液,800 r/min離心5分鐘后棄去培養(yǎng)基,加入300μl含5%新生牛血清的PBS和700μl無水乙醇,-20℃放置24小時,離心去上清,1m l PBS清洗離心,去上清后加入1mg/m l的RNaseA 100μl,37℃水浴30分鐘,加入100μg/ml的碘化丙啶（PI）300μl,暗處放置20分鐘后以流式細胞術(shù)進行細胞周期分析。

取1 ml含2×106個細胞的單細胞懸液,加入5 mmol/L的羅丹明2.5μl,37℃保溫30分鐘,800 r/min離心5分鐘,棄去培養(yǎng)液,以新鮮培養(yǎng)液洗去細胞外的羅丹明染料,37℃保溫10分鐘,再以新鮮培養(yǎng)基洗滌一次,細胞重懸于預(yù)冷的培養(yǎng)基,在流式細胞儀上檢測細胞內(nèi)的羅丹明蓄積。

1.2.6 Hep-2和Hep-2/v MDR1基因的mRNA及蛋白表達 RT-PCR法檢測MDR1的表達:用TRIzol提取Hep-2和Hep-2/v細胞的總RNA,紫外光分光光度計定量RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄過程用Oligo（dT）15法:總RNA 2μg,5×1stBuffer 4μl,DNTPs 1 μl,Oligo（dT）15 2μl,0.1mol/L DTT 2μl,RNase Inhibitor 0.5 μl,M-MLV 1μl加入 DEPC 水至20μl。反轉(zhuǎn)錄條件為25℃10分鐘,37℃1小時,4℃終止。MDR1引物 :Forward 5′-GCACTAAAGTAGGAGACAAAGGAA-3′,Reverse 5′-TGACTCTGCCATTCTGAAACAC-3′。Actin 引物 :Forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,Reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。PCR 反應(yīng)體系包括:cDNA 1μl,引物1.2μl,2×PCR Buffer for EvaGreen 10μl,20×EvaGreen染料0.6μl,Cap Taq酶0.3μl,Nuclease-Free H2O to 20 μl。反應(yīng)條件為95℃5分鐘,95℃15秒,60℃15秒,72℃20秒,76℃3秒,共40個循環(huán)。以人Actin為內(nèi)參。PCR反應(yīng)的特異性通過產(chǎn)物熔解曲線進行確認,mRNA的相對含量根據(jù)公式 Fold change=2-Δ（ΔCt）計算 。

Western blot檢測MDR1:用蛋白裂解液于冰上裂解Hep-2和Hep-2/v 30分鐘,4℃12 000×g離心40分鐘,取上清-80℃儲存?zhèn)溆?上清用 Bradford法測定蛋白濃度,樣品95℃變性5分鐘后,每孔上樣60 μg,SDS-PAGE（5%stacking gel,8%separating gel）電泳80伏2小時轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上,用4%脫脂奶粉/TBST室溫下封閉抗原1.5小時。一抗用4%脫脂奶粉/TBST稀釋后4℃孵育PVDF膜過夜（MDR1 1∶400,Mouse anti Human,Chemicon international INC）。TBST洗膜三次,每次10分鐘,然后加入二抗,室溫下?lián)u床孵育1小時,再次TBST洗膜三次,每次10分鐘。ECL曝光顯影。圖像分析儀定量分析表達蛋白的光密度。

1.3 統(tǒng)計學分析 用SPSS11.0統(tǒng)計學軟件進行多組比較方差分析。計量資料用±s表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗,計數(shù)資料比較采用 χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 多藥耐藥的檢測結(jié)果 Hep-2和Hep-2/v細胞的多藥耐藥情況,見表1。

2.2 細胞倍增時間測定及細胞形態(tài)學觀察 耐藥細胞及親本細胞的倍增時間為（28.75±1.12）小時和（42.33±1.76）小時,耐藥細胞的生長較親本細胞減慢,細胞倍增時間延長13.58小時,兩者相比差異顯著（P＜0.05）。光鏡下耐藥細胞及親本細胞均貼壁生長,Hep-2/v細胞胞體變大變圓,細胞內(nèi)的顆粒增多,細胞常呈分片聚集,貼壁能力較親本細胞減弱。見圖1。

2.3 細胞周期及細胞內(nèi)羅丹明的蓄積變化 流式細胞術(shù)分析細胞周期結(jié)果顯示Hep-2/v細胞較Hep-2細胞G0/G1期細胞升高（P＜0.05）;而S期細胞則明顯降低（P＜0.05）。見表2。流式細胞儀檢測Hep-2和Hep-2/v細胞羅丹明的陽性百分比為（95.97±0.56）%及（12.40±0.44）%。Hep-2細胞的羅丹明陽性率遠高于Hep-2/v細胞（P＜0.01）。

2.4 Hep-2和Hep-2/v MDR1基因的mRNA及蛋白表達變化 RT-PCR結(jié)果用2-△△CT方法分析,Hep-2/v細胞MDR1/Actin mRNA的相對表達量是Hep-2細胞的（9.61±6.14）倍（P＜0.01）。

Western blot結(jié)果表明MDR1/P-gp在Hep-2/v細胞內(nèi)的表達比Hep-2細胞明顯增高（P＜0.01）。見圖2。

表1 Hep-2和Hep-2/v細胞對不同化療藥物的耐藥指數(shù)（n=3）Tab.1 RI of Hep-2 and Hep-2/v cells in different drugs（n=3）

圖1 Hep-2及Hep-2/v細胞的形態(tài)學觀察Fig.1 Themorphologica l of Hep-2 and Hep-2/v cells

表2 Hep-2和Hep-2/v的細胞周期分布（n=3）Tab.2 The cell cycle distribution of Hep-2 and Hep-2/v cells（n=3）

圖2 Hep-2及Hep-2/v細胞的MDR1/P-gp的蛋白表達Fig.2 The expression of MDR1/P-gp protein in Hep-2 and Hep-2/v cells

3 討論

喉癌在頭頸部是最常見的惡性腫瘤之一,目前仍是以手術(shù)為主的綜合治療,而化療作為綜合治療的重要手段,可以抑制腫瘤細胞的微轉(zhuǎn)移和殺傷殘存的癌細胞,降低手術(shù)后局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的風險,但由于多藥耐藥的產(chǎn)生,化療的療效欠佳,因此研究喉癌的多藥耐藥及逆轉(zhuǎn)機制是臨床面臨的主要問題,而在體外建立多藥耐藥細胞系是研究腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性的重要手段[2,3]。目前國內(nèi)外建立腫瘤MDR細胞系的方法通常是采用藥物濃度遞增持續(xù)法和大劑量間歇誘導法[4],而采用藥物濃度遞增法建立的耐藥細胞系的主要優(yōu)點是耐藥性穩(wěn)定、可靠。本研究以長春新堿為誘導劑,采用藥物濃度遞增法歷時12個月誘導建立了喉癌多藥耐藥細胞系Hep-2/v,Hep-2/v細胞對VCR的耐藥性為Hep-2細胞的45倍,而且經(jīng)MTT檢測該細胞系對5-Fu、DDP等結(jié)構(gòu)及作用機制不同的抗癌藥也產(chǎn)生了不同程度的耐藥性,說明Hep-2/v具有MDR特性,是研究喉癌耐藥性及篩選逆轉(zhuǎn)劑的理想模型。

長春新堿的抗腫瘤作用主要是抑制微管蛋白的聚合而影響紡錘體微管的形成,使有絲分裂停止于中期,并且本研究的細胞周期分布分析結(jié)果中亦顯示Hep-2/v細胞與Hep-2細胞相比G0/G1期細胞的比例升高,S期細胞比例降低,這可能是耐藥細胞株生長速度變慢的原因,這種現(xiàn)象在其它的耐藥細胞研究中也有發(fā)生[5]。另外本研究通過對Hep-2及Hep-2/v細胞生長曲線的繪制并計算倍增時間發(fā)現(xiàn)Hep-2/v倍增時間較親本細胞延長了13.58小時,Hep-2/v細胞生長增殖速度明顯減慢。而腫瘤的倍增時間越長,對化療藥物的敏感性亦降低[6]。

喉癌細胞的耐藥機制非常復雜,癌基因、抑癌基因、細胞凋亡抑制基因及一些細胞因子等都可能參與耐藥的形成,而藥物外排機制占相當大的比率,它是由MDR1基因編碼的一種能量依賴性藥物排除泵,與抗癌藥物結(jié)合后再結(jié)合ATP由ATP供能將細胞內(nèi)的藥物泵到細胞外,使藥物濃度不斷降低,從而產(chǎn)生耐藥性[7,8]。本研究通過流式細胞儀檢測Hep-2和Hep-2/v細胞羅丹明的蓄積情況,顯示Hep-2細胞的羅丹明陽性率遠高于Hep-2/v細胞,表明Hep-2/v細胞的耐藥機制確實是由于MDR1基因編碼的P-gp蛋白所致。另外本研究利用RT-PCR及Westernblot分別在基因及蛋白質(zhì)水平檢測Hep-2和Hep-2/v細胞中MDR1/P-gp的表達情況,結(jié)果再次證實Hep-2和Hep-2/v兩者間MDR1/P-gp表達的顯著差異。因此我們認為對喉癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)研究可放在抑制或阻斷MDR1/P-gp的表達上。

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[收稿2009-11-21]

（編輯 張曉舟）

Establishment of a multid rug resistance cell line from human laryngeal cancer cells and itsbiologic features

YINWan-Zhong,WANGPing,ZHUWei.DepartmentofOtorhinol-AryngologyandHead-NeckSurgery,FirstHospital,JilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:To estab lish amu ltidrug resistance cell line from human laryngeal cancer cells by VCR.Methods:Human laryngeal cancercells（Hep-2）wereexposed in stepwise escalating concentration of VCR until the resistant cell（Hep-2/v）linewas developed.The IC50 and the resistance folds ofmu ltidrug resistancewere detected with MTT assay.The differences of cell cycle distribution and Rhodamine accumu lation between Hep-2 and Hep-2/v cellswere studied through flow cytometry.TheMDR1 genewere detected through real-time quantitative RT-PCR,and the corresponding proteinwas detected through western blot.Results:Hep-2/v cellswas established,which had stable resistance to VCR and a resistance index of 45;Hep-2/v cells exhibited cross resistance tomany other chemotherapeutic agents and its doubling timewas prolonged;The numberof cells in G0/G1phase was increased while in S phase decreased（P＜0.05）;Rhodamine accumu lation in Hep-2 cellswasmuchmore than Hep-2/v cells（P＜0.01）;The expression ofMDR1 were increased than that of Hep-2 cells（P＜0.01）.Conclusion:Hep-2/v cell line shows the typicalmultidrug resistance phenotype.It can be served as amodel for the study ofMDR.

Laryngealneoplasms;Vincristine;Multidrug resistance

R739.65

A

1000-484X（2010）02-0129-04

①本文受教育部博士點基金課題資助（20060183040）

尹萬忠（1970年-）,男,在讀博士,副教授,主要從事喉癌多藥耐藥研究,E-mail:yinwanzhong88@hotmail.com;

及指導教師:祝 威（1955年-）,女,教授,博士生導師,耳鼻咽喉-頭頸外科主任,主要從事頭頸腫瘤的臨床及基礎(chǔ)研究,E-mail:zhuwei3000@yahoo.com.cn。

·中醫(yī)中藥與免疫·