蓋曉東 趙麗微 歷 春 （北華大學基礎醫(yī)學院病理解剖教研室,吉林 132013）

CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞及其亞型在結(jié)直腸癌組織中分布和臨床意義的研究①

蓋曉東 趙麗微 歷 春 （北華大學基礎醫(yī)學院病理解剖教研室,吉林 132013）

目的:探討CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）及其亞型在結(jié)直腸癌組織（colorectal carcinoma,CRC）的分布和臨床病理特征的關(guān)系。方法:收集42例CRC新鮮手術(shù)標本,應用冰凍切片、免疫組織化學SP法檢測腫瘤組織和癌旁組織中FOXP3+陽性細胞數(shù),分析其與臨床病理特征的相關(guān)性;應用雙重免疫組化檢測FOXP3和ICOS表達,分析FOXP3+ICOS+Treg和FOXP3+ICOS-Treg兩種細胞亞型分布情況。結(jié)果:CRC患者腫瘤組織中FOXP3分布顯著多于癌旁組織,差異顯著（P＜0.001）;中低分化組Treg細胞數(shù)明顯高于高分化組（P＜0.01）;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Treg細胞數(shù)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）;無遠處轉(zhuǎn)移組Treg細胞數(shù)明顯高于有遠處轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）;FOXP3+ICOS+Treg細胞亞群在CRC組織中高表達,與癌旁組織相比差異顯著（P＜0.01）。結(jié)論:CRC的發(fā)生發(fā)展與其癌組織局部微環(huán)境中Treg數(shù)量變化相關(guān),Treg在CRC組織過量表達可能是導致腫瘤免疫逃逸的重要因素之一;抑制CRC微環(huán)境中浸潤性Treg細胞功能可提高腫瘤局部免疫治療效果。

結(jié)直腸癌;Treg;FOXP3;ICOS

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer,CRC）目前仍然是導致人類死亡的惡性腫瘤之一。目前主要的治療手段是采用包括手術(shù)在內(nèi)的綜合治療,但是化療藥物在殺傷癌細胞的同時,也殺傷正常細胞,限制了治療的療效。免疫系統(tǒng)對腫瘤存在特異性和非特異性應答,其機制十分復雜,涉及多種免疫細胞及其分泌的產(chǎn)物。因此,研究CRC組織微環(huán)境下免疫細胞的分布情況,將有助于了解這種疾病的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制,探索新的治療方法。

研究表明,機體可通過多種免疫機制來殺傷CRC腫瘤細胞,而腫瘤細胞本身也可利用不同的方式來逃逸這些防御機制。許多腫瘤抗原為自身抗原,腫瘤內(nèi)浸潤的FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cells,Treg）細胞能抑制T細胞對外來和自體抗原的免疫應答,因而在維持對自身成分耐受的同時也會阻止機體對腫瘤細胞的免疫應答,從而導致了腫瘤細胞的免疫逃避。

Treg代表一群獨特的CD4+輔助性T細胞亞群,在控制自身免疫中發(fā)揮著重要作用。CD4+CD25+是其主要的分子表型。FOXP3屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,是控制Treg發(fā)育及其功能效應的關(guān)鍵因素,也是Treg較特異且可靠的標記[1-3]。最新研究發(fā)現(xiàn),根據(jù)人胸腺、扁桃體、淋巴結(jié)和外周血中FOXP3+Treg細胞表面是否表達ICOS分子,可以將其分成FOXP3+ICOS+Treg和FOXP3+ICOS-Treg兩種細胞亞型[4]。

本研究通過酶標免疫組化法檢測CRC腫瘤組織和癌旁組織中Treg的分布,雙重免疫組化法檢測Treg亞型的表達,探討Treg在CRC組織的分布與臨床病理特征的相關(guān)性及其亞型的表達情況,為臨床CRC的免疫治療提供理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和主要儀器

1.1.1 試劑 小鼠抗人FOXP3單克隆抗體、小鼠抗人ICOS單克隆抗體均為eBioscience公司產(chǎn)品;即用型免疫組化超敏SP試劑盒、免疫組化雙染試劑盒、DAB顯色試劑盒、多聚賴氨酸均為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品;OCT包埋劑為SHANDON公司產(chǎn)品;其它均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 材料 本實驗共收集北華大學附屬醫(yī)院普通外科2007年10月至2009年4月間結(jié)直腸癌手術(shù)切除的新鮮標本42例,其中結(jié)腸癌19例,直腸癌23例;年齡在 36～79歲之間,平均年齡59.9±13歲;男28例,女14例。所有標本均經(jīng)病理學診斷證實,并有詳細的臨床資料。所有病例均未行放、化療及生物免疫治療。

每例標本均采集了結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織（避開壞死、炎癥區(qū)域）、癌旁組織（取自相應腫塊旁3～5 cm腸組織）。標本離體后OCT包埋,迅速置于-196℃液氮中速凍,后轉(zhuǎn)移至-85℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器 恒溫冷凍切片機（CM1900）為德國Leica公司產(chǎn)品;超低溫冰箱為日本SANYO產(chǎn)品;顯微鏡（Olympus cx21）為日本Olympus產(chǎn)品;數(shù)碼顯微鏡（Motic DM-BA400）、圖像采集系統(tǒng)（Motic Images Advanced 3.2）均為中國重慶Motic公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 所有標本制成5μm厚冰凍切片,按免疫組化SP試劑盒說明進行單染色法檢測FOXP3蛋白表達,雙染色法檢測FOXP3蛋白和ICOS蛋白的表達,用PBS代替一抗作為陰性對照。Treg細胞陽性標準:細胞形態(tài)完整,結(jié)構(gòu)清晰,棕黃色顆粒特異性定位于細胞核。FOXP3+ICOS+Treg陽性標準:黑色和紅色顆粒同時特異定位于細胞核（黑色）與細胞膜（紅色）。采用雙盲法進行觀察,隨機對每張切片選擇10個高倍視野（400×）計數(shù)陽性細胞數(shù),求其平均值。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織病理學特征 42例CRC腫瘤組織分化程度根據(jù)惡性腫瘤的組織學分級標準（Breders分級）,全部病例分為高、中-低分化兩組;臨床分期根據(jù)1986年中國全國大腸癌會議提出的Dukes分期方法修正方案及2002年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）提出的大腸癌TNM分期標準[5];原發(fā)腫瘤浸潤深度參照2002年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）標準（表1）。

2.2 CRC組織中Treg的分布 FOXP3+Treg細胞形態(tài)完整,結(jié)構(gòu)清晰,DAB顯色核呈棕黃色,散在分布于腫瘤組織中,尤其在癌組織與正常組織交界處分布密集。本實驗42例CRC組織中均有FOXP3+表達,其表達水平24.1±6.3顯著高于癌旁組織0.7±2.0,經(jīng)統(tǒng)計學分析差異顯著（P＜0.001）（表2,圖1）。

2.3 CRC組織Treg分布與臨床病理特征的關(guān)系對CRC組織中Treg分布與臨床病理特征進行分析,結(jié)果表明:在中低分化組Treg細胞數(shù)（25.8±6.5）明顯高于高分化組（18.2±4.3）,P＜0.01;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Treg細胞數(shù)（24.4±6.4）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（18.9±7.5）,P＜0.05;無遠處轉(zhuǎn)移組Treg細胞數(shù)（21.5±7.3）明顯高于有遠處轉(zhuǎn)移組（11.2±1.9）,P＜0.05。但與腫瘤浸潤深度和臨床分期相關(guān)性無統(tǒng)計學意義（表3）。

表1 42例CRC患者臨床病理特征Tab.1 Clinical characteristics of patients whose tumors were used in the tissue assay

表2 CRC組織和癌旁組織FOXP3表達水平比較Tab.2 Median density of the T-cellmakers FOXP3+in colorectal tumor tissues and peri-cancer tissue

圖1 免疫組化檢測 FOXP3+Tregs和FOXP3+ICOS+Treg在組織中表達Fig.1 Immunohistochemical staining showing the expression of FOXP3+Treg and FOXP3+ICOS+Treg in CRC tissues

表3 CRC組織FOXP3表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.3 FOXP3 expression and relationship with clinical pathological parameters

2.4 CRC組織中Treg亞型的表達 本實驗采用雙重免疫組化法檢測CRC組織中表達Treg亞型表達情況。FOXP3+ICOS+Treg細胞表現(xiàn)為黑色顆粒定位于細胞核（FOXP3+）,紅色顆粒定位于細胞膜（ICOS+）。結(jié)果:42例CRC組織中有34例可見到FOXP3+ICOS+Treg陽性細胞的表達,陽性率為81%;10例表達FOXP3+癌旁組織中,僅有1例可見到ICOS分子的弱表達,陽性率為10%,經(jīng)統(tǒng)計學分析差異顯著（P＜0.01）,（圖1）。

3 討論

腫瘤通過各種直接或間接的機制來逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)控。一系列的研究已經(jīng)證明,Treg細胞與腫瘤免疫逃避機制密切相關(guān)。在肺癌、乳腺癌、卵巢癌以及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者的外周血淋巴細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞中,存在Treg比例增高現(xiàn)象[6-9]。Treg通過細胞與細胞直接接觸或通過細胞因子的釋放,對效應性CD4+/CD8+T細胞活化和增殖發(fā)揮抑制作用。其效應機制主要是抑制CD4+T細胞增生、抑制腫瘤特異性抗原激活的CD4+效應細胞分泌 IL-2[10,11],抑制CD8+IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生,并在腫瘤微環(huán)境中能限制CTLs（Cytotoxic T lymphocytes）細胞毒性顆粒釋放,使腫瘤細胞逃逸免疫殺傷[12,13]。

因此,在以細胞免疫為主的腫瘤免疫過程中,Treg處于關(guān)鍵環(huán)節(jié),在機體免疫調(diào)節(jié)中起重要作用,決定了免疫反應的最終走向是激活免疫還是誘導耐受。本實驗研究CRC患者腫瘤組織內(nèi)浸潤的Treg細胞分布情況,發(fā)現(xiàn)CRC患者組織內(nèi)Treg數(shù)量顯著高于癌旁對照組。對Treg細胞與臨床病理參數(shù)關(guān)系進行分析后發(fā)現(xiàn):中-低分化患者癌組織中Treg數(shù)量顯著高于高分化者,腫瘤分化程度越低Treg數(shù)量越多,惡性程度越高。這些結(jié)果提示Treg在CRC腫瘤免疫中扮演重要角色,Treg可能影響了腫瘤的分化,促進了腫瘤進展。Woo等[6]首先報道了Treg表達與腫瘤侵犯局部淋巴細胞有關(guān)。本實驗也發(fā)現(xiàn),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者癌組織中Treg數(shù)量顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。提示隨著腫瘤細胞浸潤到局部淋巴結(jié),Treg介導的免疫抑制有增強趨勢。另外,本實驗還顯示一個值得注意的現(xiàn)象,Treg在局限性腫瘤的浸潤者TIL表達顯著高于有遠處轉(zhuǎn)移者。提示Treg在惡性腫瘤中的浸潤可能是一個動態(tài)過程,作為局限性腫瘤的最初反應,Treg數(shù)量增加,而腫瘤轉(zhuǎn)移擴散后Treg的數(shù)量相對減少。

根據(jù) ICOS分子的表達,將其分成FOXP3+ICOS+Treg和 FOXP3+ICOS-Treg兩組細胞。FOXP3+ICOS+Treg細胞通過IL-10、TGF-β抑制CD4+T細胞增殖,而 FOXP3+ICOS-Treg細胞僅通過 TGF-β來發(fā)揮功能[4]。在人前列腺癌、黑色素瘤研究中發(fā)現(xiàn),TIL（Tumor-infiltrating lymphocytes,TIL）中多為FOXP3+ICOShighTreg細胞群,而患者外周血及正常人群外周血以FOXP3+ICOSlowTreg細胞群為主。FOXP3+ICOShighTreg細胞比FOXP3+ICOSlow細胞對效應T細胞有著更強的抑制作用。同時,這群細胞還高表達Fas、FasL和Granzyme B,可能對Treg誘導CD4+和 CD8+細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用[14,15]。目前在CRC組織中是否存在FOXP3+ICOS+Treg和FOXP3+ICOS-Treg兩種細胞亞群尚不明確。本實驗采用雙重酶標免疫組化技術(shù)同時檢測CRC組織中FOXP3和 ICOS表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXP3+ICOS+Treg在CRC組織中的表達率明顯高于癌旁組織中的表達率。提示表達ICOS分子的Treg可能具有更強的免疫抑制功能。我們將在今后實驗中,進一步深入研究FOXP3+ICOS+Treg詳細分子作用機制。

以上結(jié)果顯示CRC的發(fā)生發(fā)展與其癌組織局部微環(huán)境中Treg數(shù)量變化有直接關(guān)系,ICOS的表達可能在調(diào)解Treg功能方面起重要作用,CRC患者的腫瘤微環(huán)境可能通過某種機制促進了Treg的分化或增殖。

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[收稿2009-06-20 修回2009-07-30]

（編輯 倪 鵬）

Distribution of CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells and their subsets in colorectal carcinoma and the clinical significance

GAIXiao-Dong,ZHAOLi-Wei,LIChun.SchoolofBasicMedicalSciences,BeihuaUniversity,Jilin132013,China

Objective:To determine the distributionof CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells（Treg）and Treg subsets in human colorectal carcinomamicroenvironment and to exp lore their correlation with conventional clinico-pathological features.Methods:Frozen sections and Immunohistochemistry（IHC）were used to detect FOXP3+Treg in fresh specimen collected from 42 patientswith colorectal carcinoma.The number of FOXP3+Tregwas evaluated in terms of its association with clinico-pathologicalfeature in tumor and peri-cancer tissue.Double staining was performed to determ ine the expression of ICOS and FOXP3.Results:The numberof FOXP3+Treg in the colorectal carcinoma（mean 24.1）was significantly higher than that in peri-cancer tissue（mean 0.7）.A highernumber of tumor infiltrating FOXP3+Tregswas found in the patientgroupswith poordifferentiation,lymphaticmetastasis and non-distantmetastasis as com pared to the patientgroupswithwell differentiation,non-lymphaticmetastasis and distantmetastasis.The percentage of FOXP3+ICOS+Tregwas higher in colorectal carcinoma（81%）than that in peri-cancer tissue（10%）.Conclusion:Increased FOXP3+Tregmay influence theoccurrence and developmentof colorectal carcinoma.Our data support the hypothesis that tumor infiltrating FOXP3+Tregs attenuate the immune response against cancerand suggest that strategy to overcome FOXP3+Treg functionmay be beneficial in the treatmentof human colorectal cancer.

Colorectal carcinoma;Treg;FOXP3;ICOS

R730.3

A

1000-484X（2010）01-0075-04

①本文受吉林省教育廳項目（吉教科合字[2008]第128號）資助

蓋曉東（1962年-）,女,博士,教授,碩士生導師,主要從事腫瘤免疫學研究及腫瘤分子病理學研究,E-mail:gaixiaodong@yahoo.com.cn。