馮海燕 劉瑞風 張開明 （山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院,太原 030000）

人骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)及向血管內(nèi)皮樣細胞分化的研究①

馮海燕 劉瑞風②張開明②（山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院,太原 030000）

目的:研究人骨髓間充質(zhì)干細胞（hMSCs）的體外分離培養(yǎng)方法及在特定微環(huán)境下分化為血管內(nèi)皮樣細胞的潛能,可能為銀屑病研究提供實驗基礎。方法:密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離人骨髓間充質(zhì)干細胞（hMSCs）,體外擴增培養(yǎng)并進行鑒定。加入血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）定向誘導hMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化,流式細胞儀進行細胞表型鑒定,Dil-ac-LDL攝取實驗鑒定血管內(nèi)皮細胞功能。結(jié)果:經(jīng)流式細胞儀測定分離培養(yǎng)的hMSCs CD71、CD44 陽性表達,CD54、CD106、CD45 弱陽性表達,CD34、CD31、VWF、KDR、HLA-DR 陰性表達;經(jīng) bFGF 、VEGF 誘導后的 hMSCs可見類似內(nèi)皮細胞樣改變,經(jīng)流式細胞術(shù)檢測,與對照組相比內(nèi)皮細胞特異表面標志 CD34、CD31、VWF、KDR表達轉(zhuǎn)為陽性（P＜0.01）,而HLA-DR、CD54、CD106、CD45表達明顯上調(diào)（P＜0.01）;誘導分化后的內(nèi)皮樣細胞具有攝取 Dil-ac-LDL的能力。結(jié)論:密度梯度離心法結(jié)合貼壁法可獲得較純的MSCs;在bFGF、VEGF誘導作用下,hMSCs具有向內(nèi)皮細胞分化潛能,產(chǎn)生功能性內(nèi)皮細胞。

骨髓間充質(zhì)干細胞;血管內(nèi)皮細胞;血管內(nèi)皮細胞生長因子;堿性成纖維細胞生長因子

骨髓間充質(zhì)干細胞（marrow stem cells,MSCs）是骨髓中除造血干細胞以外的另一類干細胞類型,具有自我更新和多向分化潛能,已證實這類細胞在合適的體內(nèi)外特定條件下可向成骨、軟骨、神經(jīng)、肌肉、皮膚和肝等多種類型的成熟細胞分化[1-4]。目前國內(nèi)外研究初步表明,骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）可作為血管內(nèi)皮細胞來源的理想的種子細胞[5]。由于我們前期工作發(fā)現(xiàn)銀屑病患者骨髓造血干細胞以及造血微環(huán)境存在異常。因此,我們推測與造血干細胞同源的骨髓間充質(zhì)干細胞可能也存在異常,且由其體外分化的血管內(nèi)皮細胞可能也具有銀屑病的發(fā)病特點。本研究擬通過體外培養(yǎng)成人MSCs,并將其體外定向誘導分化為血管內(nèi)皮樣細胞,使所得細胞具有內(nèi)皮細胞特性,為銀屑病研究提供新的平臺。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 胎牛血清（杭州四季青）、DMEM-F12培養(yǎng)基（Hyclon）、人淋巴細胞分離液（天津灝陽）、青霉素鏈霉素混合液（華北制藥廠）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF,Sigma公司,美國）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF,Sigma公司,美國）、CD44-FITC（BD公司,美國）、藻紅素標記的CD34（CD34-phycoerythrin,CD34-PE）（BD公司,美國）、CD71-FITC（BD公司,美國）、藻紅素標記的CD31（CD31-phycoerythrin,CD31-PE）（PharM ingen）、CD45-PE（BD公司,美國）、異硫氫酸熒光素標記的CD106-FITC（BD公司,美國）、HLA-DR-FITC（BD公司,美國）、鼠抗血管內(nèi)皮生長因子受體-2（vascular endothelialgrowth factor receptor-2,VEGFR-2/KDR）（Invitrogen）單克隆抗體、鼠抗血管性假血友病因子（VonWillebrand Factor,VWF）（Invitrogen）單克隆抗體、鼠抗CD54單克隆抗體（Invitrogen）、FITC標記的羊抗小鼠IgG抗體（Maxin）;DiI-ac-LDL（Invitrogen）;倒置相差顯微鏡（Olympus公司,日本）、37℃恒溫培養(yǎng)箱（Sheldon Manufacturing Inc）、流式細胞儀（BD FACSCalibur型 ,美國）。

1.2 人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng) 骨髓來自血液科健康志愿捐獻成人共5m l,肝素抗凝,用DMEM/F12培養(yǎng)液1∶1稀釋后加于人淋巴細胞分離液上部,比例為3∶1,操作時將骨髓小心貼壁滴下,避免與人淋巴細胞分離液混合。2 000 r/min離心20分鐘,吸取云霧狀的白膜層即單個核細胞層,用DMEM/F12懸浮后,以1 000 r/m in離心10分鐘,吸棄上清,重復洗滌細胞二次,之后加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12,以及青霉素（100 U/ml）鏈霉素（100μg/ml）混合液重懸,調(diào)整細胞濃度,以1×106m l-1密度接種于24孔培養(yǎng)板,置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 hMSCs體外培養(yǎng)擴增 細胞培養(yǎng)48小時后,全量換培養(yǎng)液,連同未貼壁的細胞棄去,加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM-F12,繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞,以后每3天半量換液一次,倒置相差顯微鏡下觀察生長情況。貼壁的細胞培養(yǎng)48小時后即伸展,呈長梭形或多角形,并開始呈克隆樣生長,此即為骨髓間充質(zhì)干細胞。生長14天左右近80%融合時,吸取培養(yǎng)液,用PBS液沖洗一次,去除殘余的血清培養(yǎng)液,以免影響胰蛋白酶活性。然后每孔加入200μl含0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA消化液消化3分鐘左右,倒置相差顯微鏡下觀察,待細胞變圓部分脫落后,加入含血清的培養(yǎng)液中終止消化,并輕輕吹打,以1 000 r/min離心5分鐘去消化液,加10%胎牛血清DMEM-F12培養(yǎng)液重懸,接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng),為第一代細胞,倒置相差顯微鏡下觀察生長情況。按上述方法以1∶2繼續(xù)消化傳代培養(yǎng)。

1.4 人MSCs表面標志鑒定 用FITC或PE標記的表面分子CD34、CD44、CD71抗體對第三代MSCs進行流式細胞術(shù)鑒定。

1.5 誘導分化 MSCs細胞傳至第三代時,分兩組即對照組和實驗組。對照組不加誘導劑,每三天半量換液;實驗組加誘導劑進行誘導,即加入堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）10 ng/ml,血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）20 ng/m l,2%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液,向血管內(nèi)皮細胞誘導分化。每三天半量換液,倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.6 流式細胞儀檢測 誘導0、14、24天分析細胞的表型 CD54、CD34、CD31、KDR、VWF、HLA-DR、FLT-l的表達。每個培養(yǎng)孔加入200μl0.02%EDTA消化,用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應,吸管仔細吹打,離心后去上清,PBS洗滌1遍,用PBS制成懸液每份1×105個細胞調(diào)整到100μl,用直接熒光標記的抗體時,按說明細胞懸液中直接加抗體后冰上避光孵育60分鐘,以1 300 r/min離心4分鐘棄含熒光標記抗體的PBS,再用PBS洗滌一次,以去除未結(jié)合的熒光抗體,降低背景干擾,100μl Buffer重新懸浮細胞,在4℃下保存待測;用間接熒光標記的抗體時,首先加1μl一抗,冰上孵育60分鐘,用PBS液洗一遍,再加1μl二抗（FITC標記）,避光冰上孵育40分鐘,PBS液洗一遍,100μl Buffer重新懸浮細胞,在4℃下保存待測。

1.7 DiI熒光標記法 誘導后的細胞吸棄培養(yǎng)液,PBS洗滌2遍。將熒光活性染料DiI標記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-acetylated low density lipoprotein,DiI-ac-LDL）4μg（用培養(yǎng)液稀釋）加入培養(yǎng)皿,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時,吸棄含DiI-ac-LDL的培養(yǎng)液,PBS洗3次,換新鮮培養(yǎng)液,加入30 μl UEA,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時吸棄培養(yǎng)液,PBS洗3次,流水沖去PBS,吹干后標本上滴加緩沖甘油,熒光顯微鏡下觀察誘導后hMSCs的DiI-ac-LDL攝取能力,并拍片。

2 結(jié)果

2.1 hMSCs體外分離培養(yǎng)和鑒定 形態(tài)學觀察:相差顯微鏡下,hMSCs接種2天首次換液可見少量梭形或多角形貼壁細胞,形態(tài)類似成纖維細胞 （圖1A）。7天后細胞迅速增殖;10天左右可見典型的克隆集落,中心細胞為近圓形,密集生長,外周細胞為長梭形纖維樣細胞,呈魚群狀排列,相互融合連接成片;14天左右局部細胞匯合可達80%～90%,匯合細胞形態(tài)均一,呈梭形平行排列（圖1B）。傳代的細胞增殖迅速,7天左右就可以基本融合,傳三代的MSCs經(jīng)流式細胞儀測定hMSCs表面標志CD106、CD44、CD71、CD54 陽性表達分別為 6.51%、89%,65.3%,10.6%（圖 3-1）,而 CD34、CD31、VWF 、KDR、HLA-DR 、CD45陰性表達。

2.2 細胞誘導培養(yǎng)后形態(tài)學改變 細胞誘導分化后光鏡下形態(tài)誘導后2天,細胞由原來的長梭形變短、變粗,成多角形,細胞聚集形成放射狀集落（圖2A）;繼而細胞伸出偽足相互連接,成管網(wǎng)狀排列,并形成血管腔樣結(jié)構(gòu)（圖2B）;誘導后14～21天,血管腔樣結(jié)構(gòu)密度增加。管腔直徑變得寬大,管腔樣結(jié)構(gòu)周圍有呈鋪路石樣排列的內(nèi)皮樣細胞（圖2C）。對照細胞組光鏡下觀察形態(tài)無改變。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞的生長情況（×100）Fig.1 Morphology of bone marrow mesenchymal stem cells（×100）

圖2 骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為血管內(nèi)皮樣細胞Fig.2 Differentiation of MSCs into endothelial-like cells in vitro

圖3 流式細胞術(shù)檢測hMSCS表面標志Fig.3 hMSC sur facemarkers detected by flow cytometry

圖4 流式細胞術(shù)檢測誘導14天,24天內(nèi)皮細胞表面標志KDR、CD54、CD31、HLA-DR、CD106、CD34、VWF、CD45表達比較圖Fig4 FACS ana lysis of exp ression of CD34,CD54,CD31,HLA-DR,KDR,CD106,VW F and CD45 in induced MSCs

表1 人MSCs誘導14天與24天血管內(nèi)皮細胞特異表型的表達Tab.1 Expression of specific surfacemarkers of vascular endothelial cells after induced 14 d and 24 d

圖5 熒光顯微鏡觀察誘導后內(nèi)皮樣細胞對 Dil-ac-LDL攝取能力疊加圖（×100）Fig.5 Differentiated endothelial like-cellsw ere double-positive stained with uptake of DiI-ac-LDL and binding of UEA

2.3 誘導后細胞表面抗原分析 誘導分化后14、24天流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志的表達情況,發(fā)現(xiàn)對照組不表達內(nèi)皮細胞特異性表型CD34、CD31、VWF、KDR,內(nèi)皮細胞非特異表型 CD54、CD45、HLADR、CD106表達量與0天相比無統(tǒng)計學差異;實驗組誘導后14天流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志CD34、CD31、VWF、KDR呈陽性表達與對照組比較據(jù)統(tǒng)計學差異（P≤0.01）,誘導 24天流式細胞術(shù)檢測CD34、CD31、VWF與 14天相比表達量明顯上升,差異具有顯著性,但KDR表達雖有上升,但無統(tǒng)計學差異（表1,圖4）,內(nèi)皮細胞非特異表型CD54、CD45、HLA-DR、CD106表達量與14天相比表達量明顯上升,有統(tǒng)計學差異（P≤0.01）。

2.4 誘導分化后細胞Dil-ac-LDL攝取能力 在人骨髓間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞誘導分化后第24天進行Dil-ac-LDL攝取試驗,并用DAPI細胞核染色,DiI熒光標記法結(jié)果顯示,誘導分化后的內(nèi)皮樣細胞具有攝取Dil-ac-LDL的能力（圖5）。

3 討論

銀屑病的發(fā)病機理的研究一直是國內(nèi)外皮膚科學界研究的熱點和難點,雖然眾多學者從遺傳、免疫、感染以及環(huán)境因素等多方面進行了大量的研究,但至今仍未獲得滿意的解釋。在上述多種可能的致病因素中,目前受到普遍關注的是遺傳因素和免疫功能紊亂。但是,無論由何種致病因素引起,表皮改變是銀屑病諸多異常的結(jié)果,也是本病特殊的臨床表現(xiàn)的病理基礎,其中真皮乳頭微血管增生、擴張、通透性增加又是本病表皮改變的始動因素。間充質(zhì)干細胞是一類具有多向分化潛能的干細胞,在體內(nèi)或體外特殊條件下可作為血管內(nèi)皮細胞的來源。由于我們前期工作發(fā)現(xiàn)銀屑病患者骨髓造血干細胞有異常[6,7],初步研究表明銀屑病患者造血微環(huán)境、造血干細胞及造血干細胞分化的T細胞有異常[8,9],提示造血干細胞在銀屑病發(fā)病中有重要的意義。因此,我們推測與造血干細胞同源的骨髓間充質(zhì)干細胞可能也存在異常,由其體外分化的血管內(nèi)皮細胞可能也具有銀屑病的發(fā)病特點。本實驗擬將銀屑病患者骨髓間充質(zhì)干細胞體外分化為血管內(nèi)皮細胞,觀察分化的血管內(nèi)皮細胞是否具有血管內(nèi)皮細胞的改變。

骨髓間充質(zhì)干細胞可以通過貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞分選或免疫磁珠分離法進行分離。密度梯度離心法因其簡便經(jīng)濟,效果較好而被廣為應用。我們采用1.077 g/m l的Ficoll進行分離,并通過換液逐步去除不貼壁的紅細胞和白細胞等;利用貼壁細胞粘附能力不同,間充質(zhì)干細胞傳代時所需消化時間較短的特點,去除貼壁較為牢固的巨噬細胞、單核細胞及成纖維細胞,使間充質(zhì)干細胞得以純化。目前間充質(zhì)干細胞尚未發(fā)現(xiàn)有特異性的表面標記物。各實驗室報道均有差異,一般認為間充質(zhì)干細胞表達多種表面標記物,包括細胞外基質(zhì)成分、細胞因子和生長因子及其受體等,但不表達血細胞和內(nèi)皮細胞的抗原。我們經(jīng)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞表達CD44、CD71,但不表達造血細胞系特有的 CD34、CD31、VWF、KDR、HLADR。證明經(jīng)上述方法可以獲得較純的MSCS。

MSCs的分化機制和誘導條件目前尚未闡明。多數(shù)觀點認為,MSCs的分化方向與微環(huán)境“壁龕”（niche）密切相關?！氨邶悺钡慕M織成分相當復雜,不同組織的細胞微環(huán)境有著各不相同的因子?？赡苓@就是誘導進入不同組織的MSCs獲得靶組織的表型、向不同細胞譜系分化的主要原因之一。如果將MSCs處于向血管內(nèi)皮細胞分化的微環(huán)境中,MSCs的某些特征性血管內(nèi)皮細胞基因?qū)㈤_放,并可能表達相關蛋白,從而使其直接分化為血管內(nèi)皮細胞。VEGF是間充質(zhì)干細胞分化為內(nèi)皮細胞的重要條件,可以促進BMSCs分化的同時上調(diào)KDR和FLT-l的表達,而這兩種因子在體內(nèi)血管再生以及體外促進基質(zhì)金屬蛋白酶形成毛細管樣結(jié)構(gòu)的過程中發(fā)揮重要作用,FLT-1、KDR是內(nèi)皮細胞生長的早期表面受體,主要出現(xiàn)在內(nèi)皮細胞誘導轉(zhuǎn)化的早期。Ⅷ能與血管性假血友病因子（VonWillebrand Factor,VWF）結(jié)合形成復合物,存在于循環(huán)血液中。VWF主要由血管內(nèi)皮細胞合成,在血管內(nèi)皮細胞的胞漿內(nèi)有這種復合物存在。Ⅷ因子相關抗原是內(nèi)皮細胞特異性標志.可以通過測定vWF對內(nèi)皮細胞進行鑒定。在我們設定的分化體系中,經(jīng)過14天的誘導,BMSCs獲得了成熟的內(nèi)皮細胞的特征性標志如vWF、血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（KDR）,延長誘導時間,增加這些因子的表達。HLA-DR主要存在于B淋巴細胞,單個核細胞及血管內(nèi)皮細胞的細胞膜上,在較為原始的干細胞中表達較少[10],隨著干細胞分化為成熟的組織細胞,表達量逐漸增加,本實驗中hMSCs不表達HLA-DR,但誘導后表達量逐漸增加,表明細胞分化成熟。CD54在血管新生過程中也有重要作用,腫瘤、動脈粥樣硬化、糖尿病視網(wǎng)膜病變及損傷修復中是促進血管新生的因子之一[11],CD31和CD34為血管內(nèi)皮細胞的特異性表面標志,在該誘導體系中三者表達量明顯增加,是誘導為血管內(nèi)皮細胞的有力證明。

巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞可通過清道夫受體以胞吞方式攝取ac-LDL,但廣泛分布于其他細胞表面的低密度脂蛋白受體不能攝取ac-LDL,因此ac-LDL攝取實驗常用于鑒定血管內(nèi)皮細胞[12-14]。我們進行的Dil-ac-LDL攝取實驗發(fā)現(xiàn),誘導24天后的BMSCs具有攝取Dil-ac-LDL的能力,證明這種誘導后的細胞具有血管內(nèi)皮細胞的功能。

綜上所述,目前的誘導方案能夠誘導hMSCs出現(xiàn)內(nèi)皮細胞表型,且隨著誘導時間的延長其表型特征也越明顯,提示hMSCs在體外特定條件下具有定向分化為內(nèi)皮細胞的潛能,而且這種內(nèi)皮樣細胞具有攝取Dil-ac-LDL的能力,說明也有成熟內(nèi)皮細胞的功能。由于誘導后細胞的體外三維成血管實驗,既能進一步證明我們實驗中hMSCs所分化的細胞為血管內(nèi)皮細胞,同時也能觀察銀屑病患者與正常人hMSCs分化血管內(nèi)皮細胞在形成血管過程中的差異,所以在下一步的研究中將增加體外三維成血管實驗。

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[收稿2009-07-25 修回2009-11-02]

（編輯 許四平）

Isolating culture of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and the differentiation into b lood vessel endothelial-like cells in vitro

FENGHai-Yan,LIURui-Feng,ZHANGKai-Ming.TheSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan

Objective:To study of isolating cu lture and differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into blood vesselendothelial-like cells in a specializedmicro-environment in vitro,so as to provide an experimental foundation for psoriasis.Methods:The hMSCs were isolated by density gradient centrifugation,amp lificated and identificated in vitro.Vascular endothelial growth factor（VEGF）and basic fibroblastgrow th factor（bFGF）within endothelial cellgrow thmedium（DMEM）were used to inducehMSCs differentiation into vascular endothelial-like cells.The induced hMSCswere detected by flow cytometry to find whether they had endothelial cell phenotypes.The Dil-ac-LDL ingestion assaywas used to appraises the blood vessel endothelial-like cell function.Results:In cellmorphology,the induced hMSCs transformed into endothelial-like cells.These cells expressed specific surfacemarkers of vascular endothelial-like cells such as CD34,CD106,HLA-DR,CD54,VWF,CD31,KDR and CD45 comparing to those in the controlgroup（P＜0.01）.The induced endothelial-like cells had the ability of ingesting Dil-ac-LDL.Conclusion:Combination of Density gradient centrifugation and adherentmethods can obtain pure MSCs.hMSCs can obtain endothelial cell phenotypes after induced by VEGF and bFGF in vitro.Human hMSCs have potential to differentiate into vascular endothelial-like cells.The induced endothelial-like cells have completely mature endothelial cell functional properties.

Bonemarrow-derivedmesenchymal stem cells;Vascularendothelial-like cells;Vascularendothelial grow th factor;Basic fibroblast grow th factor

R758.63

A

1000-484X（2010）01-0070-06

①本課題為國家自然科學基金資助項目（No.30771940）

②山西省太原市中心醫(yī)院皮膚科,太原030000

馮海燕（1979年-）,女,在讀碩士,主要從事銀屑病免疫發(fā)病機理研究,E-mail:marry671@sohu.com;

及指導教師:張開明（1956年-）,男,博士,教授,碩士生導師,主要從事銀屑病免疫發(fā)病機理研究,E-mail:zhangkaiming@sina.com。