張世杰 王 蕾 汪家敏 陳 曦 蔣 靚 王月穎 胡玉敏 張學(xué)光 顧宗江

（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所,蘇州 215007）

兩株鼠抗人VSIG4單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究

張世杰 王 蕾①汪家敏 陳 曦 蔣 靚 王月穎 胡玉敏 張學(xué)光 顧宗江

（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所,蘇州 215007）

目的:制備鼠抗人VSIG4分子單克隆抗體（mAb）及對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。方法:以高表達(dá)膜型VSIG4分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/VSIG4L為免疫原,常規(guī)免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術(shù),經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和多次克隆化培養(yǎng),篩選出特異分泌鼠抗人VSIG4分子的雜交瘤細(xì)胞株;采用間接免疫熒光法、Western b lot、競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)及MTT增殖試驗(yàn)等對(duì)單抗的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果:獲得2株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人VSIG4mAb的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為9A7和9D5。對(duì)mAb生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明,2株mAb均能識(shí)別巨噬細(xì)胞以及Jurkat、THP-1、H 446等腫瘤細(xì)胞株表面的VSIG4分子。對(duì)T細(xì)胞增殖抑制的阻斷實(shí)驗(yàn)顯示,這2株抗體對(duì)VSIG4分子抑制T細(xì)胞增殖均有阻斷作用。結(jié)論:成功地獲得了2株鼠抗人VSIG4功能性mAb,為進(jìn)一步研究VSIG4及其未知受體的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

VSIG4;雜交瘤;單克隆抗體;巨噬細(xì)胞

VSIG4（V-setand Ig domain containing 4）是一種新的B7家族相關(guān)蛋白,又稱(chēng)為CRIg,其最先作為免疫球蛋白超家族的Z39Ig基因被克隆出來(lái),定位于人X染色體的Xq12[1-3]。VSIG4是一種Ⅰ型跨膜分子,屬于免疫球蛋白超家族成員。人的VSIG4有兩種交替剪接形式:VSIG4L（the longer form of human VSIG4）,胞外區(qū)編碼IgV和IgC兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,VSIG4S（the short form of human VSIG4）胞外只編碼IgV結(jié)構(gòu)域,其胞內(nèi)區(qū)二者完全相同[2-4]。人VSIG4的mRNA高表達(dá)于成人肺、胎盤(pán)、肝和心臟等組織,并且發(fā)現(xiàn)VSIG4主要表達(dá)于單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞[2-7],即VSIG4主要表達(dá)于定居于肝臟、心、腎上腺、肺和腹腔等中的巨噬細(xì)胞,而在外周血單核細(xì)胞中幾乎沒(méi)有表達(dá)。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VSIG4是巨噬細(xì)胞上的補(bǔ)體受體,可結(jié)合補(bǔ)體C3的降解片段C3b和iC3b,對(duì)于病原體的吞噬起重要作用[8-10]。近來(lái)Vogt等[3]發(fā)現(xiàn)VSIG4還是一種新的B7家族相關(guān)分子,并且證實(shí)了VSIG4有抑制T細(xì)胞活化的作用。

由于對(duì)VSIG4分子的研究尚處于初始階段,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有VSIG4單克隆抗體的報(bào)道。因此,研制抗人VSIG4單克隆抗體,有利于檢測(cè)組織細(xì)胞上VSIG4分子的表達(dá)并研究其臨床意義,同時(shí)也為探討單抗對(duì)VSIG4分子的信號(hào)阻斷作用提供了有用的工具。

1 材料與方法

1.1 材料 RPM I1640、DMEM（Gibco）,小牛血清（Hyclone）,HAT、HT選擇培養(yǎng)基（Sigma）,PEG1500（Roche）,Protein G親和層吸柱（Pharmacia）,IgG亞類(lèi)快速定性試紙（Argen）;兔抗人VSIG4多克隆抗體購(gòu)自?shī)W維亞公司;細(xì)胞株:Jurkat、THP-1、H446、H460、SPCA-1均購(gòu)自ATCC,并由本實(shí)驗(yàn)室保種。轉(zhuǎn)人VSIG4基因細(xì)胞株 L929/VSIG4L、L929/VSIG4S、L929/mock 及 293T/VSIG4L、293T/VSIG4、293T/mock由本所構(gòu)建并保種,所有細(xì)胞株經(jīng)檢測(cè),均無(wú)支原體污染,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6～8周齡的雌性BALB/c小鼠（上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）,本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心協(xié)助飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立 以高表達(dá)人VSIG4分子的L929/VSIG4L基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為免疫原免疫BALB/c小鼠,腹腔注射1×107/只,第3周和第5周再次免疫。融合前3～4天加強(qiáng)免疫后,取小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0（5∶1）按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合,用含HAT的DMEM培養(yǎng),10天后改用含HT的DMEM培養(yǎng),2周后不再向培養(yǎng)基中添加HT。融合約10天后,以293T/VSIG4L基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞及293T/VSIG4S基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陽(yáng)性抗體篩選細(xì)胞,293 T/mock為陰性抗體篩選細(xì)胞。通過(guò)間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選,所獲得的陽(yáng)性克隆經(jīng)有限稀釋法亞克隆,直至抗體穩(wěn)定分泌后擴(kuò)大培養(yǎng)并及時(shí)液氮凍存。

1.2.2 mAb的Ig亞類(lèi)及特異性鑒定 采用快速定性試紙法（參照說(shuō)明書(shū)）對(duì)所獲得的mAb進(jìn)行小鼠Ig亞類(lèi)的鑒定。Western blot鑒定抗體的特異性,抗原標(biāo)本使用預(yù)冷的RIPA抽提293T/VSIG4L、293T/VSIG4S和293T/mock后所獲得的細(xì)胞膜蛋白,一抗使用雜交瘤培養(yǎng)上清（1∶50稀釋?zhuān)?二抗為羊抗鼠Ig（1∶1 000）,通過(guò)ECL化學(xué)發(fā)光成像。

1.2.3 腹水型mAb的制備及純化 采用誘生腹水法制備抗體。選擇6～8周齡雌性BALB/c小鼠,經(jīng)腹腔注射降植烷先行致敏（0.5ml/只）,1周后注射生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞5×106/只,5～10天后收集腹水。采用Protein G親和層析法純化mAb。

1.2.4 免疫熒光標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抑制分析 將抗人VSIG4mAb（9A7和9D5）分別以生物素（biotin）標(biāo)記。PBS洗滌293T/VSIG4L細(xì)胞（5×105/test）后,分別加入mAb,4℃孵育30分鐘,洗滌后接著加入生物素標(biāo)記的mAb（0.2μg/test）,4℃孵育30分鐘,洗滌后再加入avidin-PE,4℃孵育30分鐘后洗滌,進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析,同時(shí)設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.2.5 mAb對(duì)不同細(xì)胞表面VSIG4分子的識(shí)別采用M-CSF刺激外周血單核細(xì)胞獲取的巨噬細(xì)胞和本科室的腫瘤細(xì)胞株（5×105/test）,用PBS洗滌后分別加入2株生物素標(biāo)記的mAb 9A7和9D5,4℃孵育30分鐘,洗滌后加入avidin-PE,4℃孵育30分鐘,洗滌后上流式細(xì)胞儀分析表型。

1.2.6 單抗對(duì)VSIG4分子的信號(hào)阻斷作用 分別用絲裂霉素MMC（20 mg/L）處理基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞293T/VSIG4L及293T/VSIG4S 2小時(shí),洗滌后分別將它們與9A7和9D5單抗共育40分鐘后作為效應(yīng)細(xì)胞。從PBMC中經(jīng)磁珠純化的T細(xì)胞,將上述處理的效應(yīng)細(xì)胞（1×104/孔）與T細(xì)胞（1×105/孔）混合,接種到預(yù)先用抗人CD3激發(fā)型mAb（0.5mg/L）包被的96孔板中。共培養(yǎng)3天后以MTT法測(cè)定T細(xì)胞增殖情況。每組均以相同條件下293T/mock基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未加抗體的293T基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 特異分泌鼠抗人VSIG4 mAb雜交瘤的建株通過(guò)L929/VSIG4L轉(zhuǎn)基因細(xì)胞連續(xù)3次免疫小鼠,第4次加強(qiáng)免疫后的血清抗體效價(jià)可達(dá)1∶103以上。采用雜交瘤技術(shù),對(duì)免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。用293T/VSIG4L及293T/mock細(xì)胞分別作為抗體篩選的陽(yáng)、陰性細(xì)胞株,多次間接免疫熒光法篩選及克隆化培養(yǎng),最終獲取2株持續(xù)分泌特異性mAb的雜交瘤細(xì)胞株,命名為9A7和9D5。單抗 9A7能特異性識(shí)別結(jié)合L929/VSIG4L、L929/VSIG4S和293/VSIG4L、293/VSIG4S基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞;單抗9D5識(shí)別L929/VSIG4L和293/VSIG4L,但不識(shí)別L929/VSIG4S和293/VSIG4S;且此兩株上清均不與對(duì)照細(xì)胞L929/mock和293/mock結(jié)合（圖1、2）。在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)3個(gè)月以上或液氮凍存半年后復(fù)蘇,雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好,分泌抗體的性能穩(wěn)定。

圖1 FCM分析單抗9A7與VSIG4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合Fig.1 FCM analysis of 9A7 m Ab recognizing the VSIG4 on the transfected cells

2.2 mAb Ig亞類(lèi)、效價(jià)及特異性的鑒定 經(jīng)快速定性試紙法鑒定2株抗體的重鏈均為IgG1,兩者輕鏈均為κ。采用本室建立的腹水誘生方法生產(chǎn)的mAb效價(jià),經(jīng)間接免疫熒光及FCM分析,腹水型mAb及純化后抗體的效價(jià)均在1∶104以上,純化后抗體蛋白含量在2.0～2.5 g/L之間。Western blot分析結(jié)果顯示9A7能與VSIG4L和VSIG4S蛋白特異性結(jié)合,在43 kD上下有明顯陽(yáng)性條帶,而9D5則只在VSIG4L泳道的47 kD左右有明顯特異性結(jié)合顯色條帶（圖3）。

2.3 單克隆抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn)分析 以L(fǎng)929/VSIG4L為競(jìng)爭(zhēng)靶細(xì)胞,經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn),結(jié)果顯示,單抗9A7和9D5不能相互阻斷對(duì)方與L929/VSIG4L細(xì)胞上VSIG4L分子的結(jié)合（圖4）。

圖2 FCM分析單抗9D5與VSIG4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合Fig.2 FCM analysis of 9D5 m Ab recognizing the VSIG4 on the transfected cells

圖3 2株m Ab特異性識(shí)別VSIG4分子不同剪接體的Western blot分析Fig.3 Western b lot analysis of twom Abs specifically recognizing the two sp liceosomes of VSIG 4

2.4 單克隆抗體對(duì)不同人腫瘤細(xì)胞株及巨噬細(xì)胞表面VSIG4分子的識(shí)別 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞膜熒光標(biāo)記百分率結(jié)果表明,mAb 9A7和9D5均能特異識(shí)別M-CSF激發(fā)形成的人巨噬細(xì)胞上表達(dá)的VSIG4分子（圖5）,但是在PBMC中貼壁單個(gè)核細(xì)胞上近乎沒(méi)有VSIG4分子表達(dá)。在檢測(cè)腫瘤細(xì)胞株時(shí)發(fā)現(xiàn),它們均能識(shí)別白血病細(xì)胞株Jurkat、THP-1和肺癌細(xì)胞株H446、H460、SPCA-1（圖6）。

2.5 單抗阻斷VSIG4分子對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用 體外以抗人 CD3單抗激發(fā) T細(xì)胞增殖,以VSIG4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞抑制,并加入本研究中制備抗體觀察其阻斷此效應(yīng),MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,采用10 mg/L抗人VSIG4單克隆抗體9A7和9D5均能一定程度地阻斷VSIG4L介導(dǎo)的對(duì)T細(xì)胞的抑制作用（P＜0.05）,但9D5的阻斷效應(yīng)不及9A7。同時(shí)9A 7也能阻斷VSIG4S介導(dǎo)的對(duì) T細(xì)胞的抑制作用（P＜0.05）,但是 9D5對(duì) VSIG4S沒(méi)有阻斷作用（P＞0.05）,（圖 7）。

圖4 間接免疫熒光標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)果Fig.4 The competitive inhibition results acquired by indirect immunofluorescence

圖5 FCM檢測(cè)2株m Ab與單核細(xì)胞M0和巨噬細(xì)胞Mφ的結(jié)合反應(yīng)Fig.5 Detection of binding of the twom Abs tomonocyte（M 0）and macrophage（Mφ）by FCM

圖6 FCM檢測(cè)2株m Ab與人腫瘤細(xì)胞株結(jié)合反應(yīng)Fig.6 Detection of binding of the twom Abs to human cancer cell lines by FCM

圖7 單抗阻斷VSIG4分子對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.7 Blockingof the VSIG4 inhibitory effects on proliferation of T cells by m Ab

3 討論

本研究以鼠源性L(fǎng)929細(xì)胞株構(gòu)建成的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/VSIG4L免疫BALB/c小鼠制備單克隆抗體。經(jīng)反復(fù)篩選及多次的克隆化培養(yǎng),最終獲得2株持續(xù)分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株9A7和9D5。間接免疫熒光分析表明,9A7均可特異性識(shí)別表面有VSIG4L或VSIG4S的293T和L929基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞;9D5只能識(shí)別VSIG4L的293T和L929基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞,而VSIG4S的則不能識(shí)別。由于VSIG4L和VSIG4S是VSIG4分子不同的兩種長(zhǎng)短剪接體形式,即VSIG4L胞外區(qū)編碼IgV和IgC兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,而短剪接體形式的VSIG4S胞外只編碼IgV結(jié)構(gòu)域,二者的胞內(nèi)則完全一致。同時(shí)以Western blot檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)9A7能與VSIG4L和VSIG4S結(jié)合,9D5僅能和VSIG4L結(jié)合,說(shuō)明9A7和9D5可以用作Western blot檢測(cè),并且9A7和9D5的結(jié)合特異性也與間接免疫熒光分析結(jié)果相同。這些結(jié)果可基本判定9A7是與VSIG4L的IgV結(jié)構(gòu)域結(jié)合;而9D5是與IgC結(jié)構(gòu)域結(jié)合。上述結(jié)果尚不能排除IgV結(jié)構(gòu)域和IgC結(jié)構(gòu)域存在相同或相近的抗原位點(diǎn),但9A7和9D5與VSIG4L的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)二者不存在競(jìng)爭(zhēng)抑制,說(shuō)明9A7和9D5結(jié)合于IgV和IgC不同的抗原表位上。對(duì)兩株單抗的生物學(xué)功能研究結(jié)果表明,單抗9A7在一定程度上能夠阻斷VSIG4分子對(duì)T細(xì)胞的負(fù)性作用,使T細(xì)胞增殖增加,9D5僅能較低程度的阻斷VSIG4L的抑制作用,且阻斷效應(yīng)不及9A 7明顯,而對(duì)VSIG4S幾乎沒(méi)有作用。所以可以推測(cè)VSIG4分子與其T細(xì)胞上表達(dá)的未知的受體的結(jié)合區(qū)域可能主要位于VSIG4分子的IgV結(jié)構(gòu)域內(nèi)。同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)[3]、本文及我們以前的研究結(jié)果[11],可以確定VSIG4分子的未知受體是T細(xì)胞上一個(gè)新的負(fù)性共刺激分子。

腫瘤的微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和攻擊的重要因素,腫瘤微環(huán)境中存在著高水平的抑制性B7分子。利用9A7和9D5,我們檢測(cè)了B7家族中新的抑制性分子VSIG4在腫瘤細(xì)胞株Jurkat、THP-1上的表達(dá),其結(jié)果為陽(yáng)性,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5-7]。同時(shí)也檢測(cè)了部分肺癌細(xì)胞株,也發(fā)現(xiàn)它們的表面有不同程度的VSIG4分子的表達(dá),且9A7和9D5間沒(méi)有明顯差別。是否VSIG4和它的未知受體是腫瘤微環(huán)境中起重要作用的一對(duì)新分子,有待進(jìn)一步研究。

總之,對(duì)于VSIG4分子的研究尚處于初始階段,鼠抗人VSIG4單克隆抗體9A7和9D5研制成功為深入探討VSIG4分子的功能、表達(dá)定位以及共抑制分子對(duì)T細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)作用提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ),也對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)負(fù)性共信號(hào)分子在介導(dǎo)免疫應(yīng)答平衡、腫瘤的免疫逃逸和維持外周耐受等的生物學(xué)機(jī)理方面具有重要意義。

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11 張世杰,王 蕾,王月穎etal.人VSIG4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建及其對(duì)T細(xì)胞的共刺激效應(yīng)的初步研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2009;25（5）:397-401.

[收稿2009-02-10 修回2009-06-29]

（編輯 倪 鵬）

Preparation and characterization of two monoclonal antibodies against human VSIG4

ZHANGShi-Jie,WANGLei,WANGJia-Min,CHENXi,JIANGJing,WANGYue-Ying,HUYu-Min,ZHANGXue-Guang,GUZong-Jiang.BiotechnologyInstituteofSoochowUniversity,Suzhou215007,China

Objective:To prepare anti-VSIG4 monoclonal antibodies and characterize their biological functions.Methods:BALB/c mice were immunized with transfected cell line（L929/VSIG4L）as immunogen.The spleen B cellsof themicewere fusedwith SP2/0 and hybridoma cellswere screened with transfected cell line（L929/VSIG4）by FCM.After acquisition of the hybridomas secreting anti-VSIG4mAb,theirbiologicalactivitieswere investigated by indirect immunofluorescence,Western blot,competitive inhibition test,and MTT assay.Results:Two stable hybridomas,9A7 and 9D5wereobtained,which could continuously secrete specific anti-VSIG4monoclonal antibodies.The following biologicalactivity studies showed that thesemonoclonal antibodies could recognize thenatural VSIG4 expressed on themacrophages and several cancer cell lines,such as Jurkat,THP-1 and H446.Furthermore,they could block the inhibitory effects of VSIG4 on proliferation of T cells in vitro.Conclusion:Two hybridomas secreting anti-VSIG4monoclonal antibodies have been established.Thesemonoclonal antibodies provideuseful tools for further studying VSIG4′s biological function and its unknown receptor.

VSIG4;Hybridoma;Monoclonal antibody;Macrophage

R392.12

A

1000-484X（2010）01-0066-05

①蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科,蘇州215006

張世杰（1979年-）,男,博士,主要從事腫瘤免疫研究;通訊作者及指導(dǎo)教師:顧宗江（1956年-）,男,教授,主要從事腫瘤免疫和免疫調(diào)節(jié)研究,E-mail:szguzj@pub.sz.jsinfo.net。

·臨床免疫學(xué)·