楊 霞 劉凱軍 申子剛 何海洋 張 記 張巧玉 吳玉章 李晉濤

（第三軍醫(yī)大學(xué)全軍免疫學(xué)研究所,重慶 400038）

人Izumo蛋白的二級結(jié)構(gòu)及B細胞抗原表位預(yù)測①

楊 霞 劉凱軍②申子剛 何海洋 張 記 張巧玉③吳玉章 李晉濤

（第三軍醫(yī)大學(xué)全軍免疫學(xué)研究所,重慶 400038）

目的:預(yù)測人Izumo蛋白的二級結(jié)構(gòu)及B細胞抗原表位。方法:以人Izumo基因序列為基礎(chǔ),按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法預(yù)測其編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu),采用Karplus-Schulz方法預(yù)測Izumo蛋白骨架區(qū)的柔韌性;按Kyte-Doolittle方法預(yù)測其親水性、Emini方法預(yù)測蛋白質(zhì)表面可能性及Jameson-Wolf方法預(yù)測抗原性指數(shù)。結(jié)果:Chou-Fasman及Gamier-Robson兩種方法預(yù)測的結(jié)果均表明,Izumo蛋白含較多的α螺旋,蛋白第 6～ 17、30～ 40、88～ 99、103～ 120、153～ 160、173～ 188、249～ 260、283～297、334～338和339～346區(qū)段可能是α螺旋中心,第21～25、198～200、245～248和320～323區(qū)段可能是β折疊中心。用Kyte-Doolittle、Emini和Jameson-Wolf方法分別對Izumo蛋白B細胞抗原表位進行預(yù)測結(jié)果表明,蛋白質(zhì)第36～42、62～66、94～99、118～ 122、129～ 132、151～ 154、161～ 164、173～ 177、205～ 208、212～ 216、256～ 265、271～ 276、283～ 288、314～ 318 和 336～ 350區(qū)段附近很可能為B細胞表位優(yōu)勢區(qū)域。結(jié)論:該研究結(jié)果有助于確定Izumo蛋白的B細胞優(yōu)勢表位及發(fā)揮免疫避孕的活性部位。

人Izumo蛋白;二級結(jié)構(gòu);B細胞優(yōu)勢表位

Izumo蛋白特異表達于精子表面,定位于精子頭部[1]。在新鮮精子的表面檢測不到Izumo蛋白的表達,發(fā)生頂體反應(yīng)以后在小鼠和人類精子的表面能檢測到Izumo蛋白的表達并且精子可育[2]。正常情況下,只有發(fā)生了頂體反應(yīng)的精子才能被Izumo抗體著色[3]。推測Izumo蛋白可能不是定位在新鮮精子質(zhì)膜上而是隱藏在質(zhì)膜下,頂體反應(yīng)發(fā)生以后才暴露出來。同源重組技術(shù)敲除的Izumo-/-雌鼠生育正常;Izumo-/-雄鼠生長健康,交配、射精行為正常;精子發(fā)育正常,運動力及遷移能力沒有影響,但精子不育。進一步的研究表明Izumo-/-雄鼠精子能與去除卵透明帶的卵子質(zhì)膜結(jié)合,但不能和卵子融合[2]。

目前的研究結(jié)果表明,Izumo蛋白可望成為新型男性免疫避孕的靶抗原。本研究在已獲得Izumo氨基酸序列的基礎(chǔ)上,運用計算機技術(shù)和分子生物學(xué)軟件對Izumo蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和B細胞抗原表位進行分析和預(yù)測,為確定Izumo蛋白B細胞優(yōu)勢表位及發(fā)揮免疫避孕的活性部位和制備Izumo蛋白單克隆抗體提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 Izumo氨基酸序列選擇 選取來自人源睪丸組織的Izumo蛋白（由基因序列推導(dǎo)）共有350個氨基酸殘基,相對分子質(zhì)量為39 kD,等電點為6.35。檢索自NCBI數(shù)據(jù)庫,基因登錄號為BC034769,具體序列見圖1。

1.2 Izumo蛋白的二級結(jié)構(gòu)及柔性區(qū)域的預(yù)測 應(yīng)用DNAStar Protean軟件提供的模塊進行,采用Chou-Fasman方法通過序列氨基酸殘基的晶體結(jié)構(gòu)來預(yù)測二級結(jié)構(gòu);采用Gamier-Robson方法通過計算特定氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性來分析預(yù)測Izumo蛋白的二級結(jié)構(gòu)。采用Karplus-Schulz方法對Izumo蛋白骨架區(qū)的柔韌性進行分析。

1.3 Izumo蛋白的B細胞表位預(yù)測 應(yīng)用DNAStar Protean軟件進行,采用Kyte-Doolittle方法的氨基酸親水性標準,預(yù)測其親水性;采用Emini方法預(yù)測蛋白質(zhì)的表面可能性;以及采用Jameson-Wolf方法預(yù)測抗原性指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Izumo蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 用Chou-Fasman方法預(yù)測Izumo蛋白二級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其形成許多α螺旋,位置分別在第 6～17、30～ 40、44～ 73、79～ 83、88～ 99、103～120、131～ 134、153～ 161、173～ 188、215～221、254～262、283～298、334～338和 339～ 346區(qū)段。預(yù)測結(jié)果也顯示在分布區(qū)段上α螺旋與β折疊交叉分布,在各β折疊單元之間存在豐富的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（圖2）。采用Gamier-Robson法預(yù)測Izumo蛋白二級結(jié)構(gòu),同樣發(fā)現(xiàn)其形成大量α螺旋,位置分別在第3～21、25～ 85、87～ 100、101～ 132、141～ 150、153～160、169～190、207～ 219、225 ～ 228、230 ～ 233、249～260、271～276、283～297、299～320和 332～ 350區(qū)段。用該方法預(yù)測的β折疊結(jié)構(gòu)較Chou-Fasman方法預(yù)測的數(shù)量要少。在各α螺旋單元之間存在長短不一的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（圖3）。

綜合Chou-Fasman和Gamier-Robson兩種方法預(yù)測的結(jié)果,Izumo蛋白含較多的α螺旋,該蛋白第6～17、30～ 40、88 ～ 99、103～ 120、153 ～ 160、173～188、249～260、283～ 297、334～338和339～ 346區(qū)段可能是α螺旋中心。Izumo蛋白第21～25、198～200、245～248和320～323區(qū)段可能是β折疊中心。

圖1 人Izumo氨基酸序列Fig.1 Am ino acid sequence of Izumo in Homosapiens

圖2 Chou-Fasman方法預(yù)測Izumo蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.2 The secondary structure of Izumo protein predicted by Chou-Fasmanmethods

圖3 Gamier-Robson方法預(yù)測Izumo蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.3 The secondary structure of Izumo protein predicted by Gam ier-Robson methods

2.2 Izumo蛋白骨架區(qū)的柔性分析 Izumo蛋白骨架區(qū)含有較多的柔性區(qū)域,主要集中在蛋白第33～42、62～ 66、79 ～ 87、92～ 105、118～ 122、136 ～ 138、152～ 155、166～ 169、173 ～175、189～ 195、203～ 221、223～ 230、236～ 243、258 ～266、268～ 280、281～ 287、322～326和330～348區(qū)域（圖4）。這些區(qū)域可能具有一定的柔韌性,發(fā)生扭曲、折疊的幾率較高,形成表位的可能性較大,容易與抗體進行嵌合。由于Izumo是一種具有組織特異性表達的分子,在精卵結(jié)合發(fā)生頂體反應(yīng)的時候特異表達,抗Izumo抗體可直接阻斷精卵融合,從而發(fā)揮免疫避孕功能。

2.3 Izumo的親水性分析 按Kyte-Doolittle的氨基酸親水性標準分析Izumo的親水性,預(yù)測結(jié)果表明Izumo蛋白分子Izumo親水性區(qū)域的分布不均勻,主要密集在中部和C末端,尤其以中部親水性最高,親水性較高區(qū)域為第 36～77、82～108、116～124、128～ 139、149～176、184～220、223 ～239、257～ 270、272～276、278～290、313～320和334～350區(qū)段（圖5）。這些親水性區(qū)域暴露于蛋白表面的幾率較大,成為抗原表位的幾率也較大。

2.4 Izumo蛋白的表面可能性分析 采用Emini方法對Izumo蛋白的表面可能性進行了分析。結(jié)果顯示Izumo蛋白的氨基酸表面可能性較大的區(qū)域主要是第36～40、48～ 52、93～ 99、117～ 124、129～ 133、204～ 208、212～ 219、227 ～ 231、257～ 264、271 ～ 276、283～289、313～318和 335～350區(qū)段,其它區(qū)段展示的表面可能性較小或表現(xiàn)為負值（圖6）。表明表面可能性較高區(qū)域呈現(xiàn)在Izumo分子表面,而表面可能性較低區(qū)域,即埋藏于分子內(nèi)部的區(qū)域。

2.5 Izumo抗原指數(shù)分析 采用Jameson-Wolf方法分析 Izumo蛋白潛在的抗原表位位點,結(jié)果顯示Izumo蛋白質(zhì)分子第 35～42、45～67、69～75、79～89、92～108、117 ～ 123、129 ～ 141、149 ～ 182、189～198、203～209、210 ～ 220、223～ 244、256～280、283 ～292、313～322和 330～350區(qū)段抗原指數(shù)較高（圖7）,提示這些區(qū)段含有潛在優(yōu)勢抗原表位。

圖4 Izumo的柔性區(qū)域Fig.4 Flexib le regions of Izumo protein

圖5 Izumo蛋白的親水性分析Fig.5 Hyd rophilicity analysis of Izumo protein

圖6 Izumo蛋白表面可能性區(qū)域Fig.6 Surface probability regions of Izumo protein

圖7 Izumo蛋白抗原指數(shù)分析Fig.7 Antigenic index of Izumo protein

3 討論

當(dāng)前研發(fā)男性免疫避孕疫苗,進行抗生育研究的靶標分子主要有兩方面:①精子表面在受精過程中發(fā)揮作用的蛋白;②參與精子與卵細胞表面卵透明帶結(jié)合的蛋白。目前針對精子特異表達分子的研究主要有 LDH-C4 、FA-1、SP10、SP17、PH-20、PH-30、（SAMP）32、ADAM、CD9、YLP12等[4],但它們大部分抗生育效率不高。其中睪丸特異表達分子Eppin的研究成果向生育學(xué)家展示出誘人的魅力,重組Eppin免疫雄猴使78%的雄猴產(chǎn)生高滴度的特異抗體并出現(xiàn)不育癥,免疫停止后能恢復(fù)育性[5,6]。目前的研究都還僅僅只停留在動物模型研究上,尚沒有一種真正可用于臨床的安全、長效、可逆的男性避孕抗原問世。

Izumo是目前唯一報道的精子膜蛋白,為免疫球蛋白超家族Ⅰ型膜蛋白新成員,含一個糖基化位點的胞外免疫球蛋白域,在2005年由日本學(xué)者Inoue等命名并首次報道。研究表明Izumo蛋白的糖基化位點對于Izumo蛋白發(fā)揮功能不是必需的[7]。在動物受精過程中,精子與卵子相遇、識別對方,并融合形成一個新的生命體。Izumo蛋白在發(fā)生頂體反應(yīng)后,精子和卵子融合過程中發(fā)揮重要作用[8],可見Izumo蛋白為控制生育提供了理想的靶標,成為人類避孕領(lǐng)域關(guān)注的新焦點。研究者預(yù)言,運用RNAi技術(shù)可以開發(fā)出Izumo長效避孕的方法,在睪丸中注射Izumo雙鏈RNA（從睪丸中分離獲得IzumomRNA而來）,抑制睪丸中Izumo蛋白的表達量從而可以達到男性長效避孕。此外,通過注射Izumo單抗,抗原與抗體結(jié)合抑制精卵結(jié)合從而達到短期避孕。體外研究的結(jié)果表明鼠Izumo抗體能阻止精卵融合,但體內(nèi)研究顯示鼠Izumo抗體并不影響小鼠生育[9]。進一步的研究表明,Izumo抑制小鼠試管受精生育率及交配率是依賴于劑量效應(yīng)[10]。Izumo蛋白真正成為高效的免疫避孕靶抗原尚需進一步研究。

抗原的特異性主要由其特定的表位來體現(xiàn),抗原的研究也正在由天然大分子向亞單位、表位多肽過渡。一個理想的疫苗應(yīng)該是屏蔽病理、劣勢、非中和的表位,多個優(yōu)勢、中和性表位的組合。研究蛋白的二級結(jié)構(gòu)并預(yù)測B細胞優(yōu)勢抗原表位,對于進一步探索蛋白的活性功能具有重要作用。2008年本課題組預(yù)測出Eppin優(yōu)勢中和性B細胞表位,體外動物實驗表明75%所預(yù)測的潛在表位位點能與抗血清結(jié)合[11]。進一步的研究表明,動物實驗篩選出優(yōu)勢表位抗原肽均能使雄性小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高滴度抗體,但并非所有篩選出的優(yōu)勢表位抗原肽均能產(chǎn)生較好的抗生育效能[12]。由此可見,蛋白二級結(jié)構(gòu)及B細胞抗原表位預(yù)測的結(jié)果為蛋白活性部位發(fā)揮功能提供研究靶標位點,但是抗原發(fā)揮活性的表位尚需與深入的蛋白功能驗證相結(jié)合才能確定。目前全世界Izumo蛋白抗生育的研究正如火如荼地進行,但尚少見Izumo表位成功預(yù)測及鑒定的報道。

本研究運用目前發(fā)展成熟的分子生物學(xué)軟件對Izumo的二級結(jié)構(gòu)和表位特性,如親水性、柔韌性、表面可能性及抗原指數(shù)等方面進行分析,成功預(yù)測其B細胞抗原表位。結(jié)果表明Izumo存在多個潛在的抗原表位位點,蛋白第 36～42、62～66、94～99、118～ 122、129～132、151 ～154、161～ 164、173～ 177、205～ 208、212～216、256 ～265、271～ 276、283～ 288、314～318和336～350區(qū)段附近可能為B細胞表位優(yōu)勢區(qū)域。其優(yōu)勢表位的確證在進一步研究中。

1 Yamashita M,Yamagata K,Tsumura Ketal.Acrosome reaction ofmouse epididymal sperm on oocyte zona pellucida[J].JReprod Dev,2007;53:255-262.

2 Inoue N,Ikawa M,Isotani Aetal.The immunoglobulin superfam ily protein Izumo is required for sperm to fusewith eggs[J].Nature,2005;434:234-238

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7 Inoue N,Ikawa M,Okabe M.Putative sperm fusion protein IZUMO and the role of N-glycosylation[J].Biochem Biophys Res Commun,2008;377:910-914.

8 Yamashita M,Honda A,Ogura Aetal.Reduced fertility ofmouse epididymal sperm lacking Prss21/Tesp5 is rescued by sperm exposure to uterinem icroenvironment[J].Genes to Cells,2008;13:1001-1013.

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10 Wang M,Lv Z,Shi Jetal.Immunocontraceptive potential of the Ig-like domain of Izumo[J].Mol Reprod Dev,2009;76（8）:794-801.

11 李晉濤,陳正瓊,梁志清etal.Eppin抗原的二級結(jié)構(gòu)分析B細胞表位預(yù)測[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2008;30（24）:2254-2257.

12 Chen Z,HeW,Liang Zetal.Protein prime-peptideboostasanew strategy induced an Eppin dominant B-cell epitope specific immune response and suppressed fertility[J].Vaccine,2009;27（5）:733-740.

[收稿2009-05-10 修回2009-07-16]

（編輯 倪 鵬）

Prediction of the secondary structure and B cell epitopes for the Izumo p rotein of Homo Sapiens

YANGXia,LIUKai-Jun,SHENZi-Gang,HEHai-Yang,ZHANGJi,ZHANGQiao-Yu,WUYu-Zhang,LIJin-Tao.InstituteofImmunology,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China

Objective:To predictand analyze the secondary structure and B cell epitopes of Izumo protein.Methods:The secondary structure and flexible regions of Izumo protein were predicted by themethods of Chou-Fasman,Gam ier-Robson and Karplus-Schulz.Moreover,hydrophilicity plot,surface probability plot and antigenic index of Izumo protein were predicted by themethods of Kyte-Doolittle,Emini and Jameson-Wolf,respectively.Results:Izumo protein containedmoreαhelix regions.Therewere several centersofαhelix in the regions of6-17,30-40,88-99,103-120,153-160,173-188,249-260,283-297,334-338 and 339-346 of Izumo p rotein,and several centers ofβsheet in the regions of21-25,198-200,245-248 and 320-323.Moreover,many distinct B cell epitopesin Izumo protein possibly localized in the regionsof 36-42,62-66,94-99,118-122,129-132,151-154,161-164,173-177,205-208,212-216,256-265,271-276,283-288,314-318 and 336-350.Conclusion:These results are helpful for identification of the dominant B cellepitopes and the functional domains of Izumo protein.

Izumo protein;Secondary structure;B cell epitopes

R392.11

A

1000-484X（2010）01-0037-04

①本文受國家自然科學(xué)基金（30571708）、“十一五”國家科技支撐計劃（2006BAI03B12）資助

②為共同第一作者

③解放軍總醫(yī)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,北京100091

楊 霞（1979年-）,女,博士,講師,E-mail:oceanyx@126.com;

及指導(dǎo)教師:李晉濤（1970年-）,女,博士,副教授,主要從事病毒免疫學(xué)研究,E-mail:ljtqms@yahoo.com.cn。