萬 琳 胡 鑫 趙賢賢 李曉燕 李卓婭 尹丙姣

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所,武漢 430030）

髓樣抑制細(xì)胞免疫抑制機(jī)理的研究①

萬 琳 胡 鑫 趙賢賢 李曉燕 李卓婭 尹丙姣

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所,武漢 430030）

目的:研究荷瘤小鼠來源的髓樣抑制細(xì)胞（Myeloid derived suppressor cell,MDSC）在腫瘤免疫抑制中的作用機(jī)理。方法:用Percoll分離法從荷瘤小鼠的脾臟和骨髓中分離Gr-1+CD11b+MDSC;用流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSC對T細(xì)胞增殖的抑制作用;分別用生化法和ELISA技術(shù)檢測MDSC體外培養(yǎng)上清中抑制性因子NO、ROS和IL-10、TGF-β的含量。結(jié)果:MDSC在荷瘤小鼠的脾臟和骨髓中聚集增多,且其在骨髓中所占的比例顯著高于脾臟;MDSC可以明顯抑制脾臟細(xì)胞的增殖,體外培養(yǎng)6小時的MDSC可以分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)MDSC可以通過分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β抑制T細(xì)胞增殖。

髓樣抑制細(xì)胞;NO;ROS;IL-10;TGF-β

多年來對腫瘤疫苗的研究,雖然在動物實(shí)驗(yàn)中取得了良好的效果,但是臨床效果欠佳[1],其重要原因是腫瘤抗原可以產(chǎn)生免疫逃避現(xiàn)象,抑制機(jī)體免疫功能[2-4]。人們對腫瘤免疫耐受機(jī)制進(jìn)行了深入的探討和研究,發(fā)現(xiàn)在慢性炎癥的局部和腫瘤組織中聚集有大量的未成熟髓樣抑制細(xì)胞（Myeloid derived suppressor cells,MDSC）,該細(xì)胞是一群異質(zhì)性細(xì)胞,它包括未成熟的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和粒細(xì)胞等,其共同的表面標(biāo)志為Gr-1+CD11b+,具有很強(qiáng)的免疫抑制作用,是引起腫瘤免疫逃逸的重要細(xì)胞群體[5-7]。目前研究證實(shí),MDSC的免疫抑制作用與兩種精氨酸代謝酶密切相關(guān):Ⅰ型精氨酸酶（arginase-1,ARN-1）和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（Inducible nitricoxide synthase,iNOS也稱NOS-2）[8-15]。同時MDSC能分泌免疫抑制因子,如集落刺激因子、TGF-β、IL-10等抑制T細(xì)胞分化[16-20]。本研究采用Percoll密度梯度離心法從荷瘤小鼠骨髓中分離MDSC,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定此法分離的50%～60%Percoll界面之間的細(xì)胞中有80%為Gr-1+CD11b+MDSC,以此MDSC為對象,研究其對T細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)理,為腫瘤免疫逃逸機(jī)理及臨床抗腫瘤治療研究提供新的實(shí)驗(yàn)手段和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、細(xì)胞系與主要試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6～8周齡C57BL/6J小鼠（購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心）。

1.1.2 細(xì)胞株 C57BL/6J小鼠肺癌細(xì)胞株LLC（Lewis Lung Cancer）（曹雪濤教授惠贈）。

1.1.3 主要試劑 DMEM、RPM I1640培養(yǎng)基（Gibco公司,美國）;小牛血清（杭州四季青生物工程公司）;Percoll（Amersham 公司,美國）;FITC-anti-Gr-1+、PE-anti-CD11b+、PE-anti-CD3 與 PE-anti-TNF-a（eBioscience公司,美國）;CFSE、乙酰肉豆蔻佛波酯PMA、離子霉素 Iono mycin（Sigma公司,美國）;mIL-10 ELISA試劑盒、mTGF-βELISA試劑盒（eBioscience公司,美國）;一氧化氮試劑盒、羥自由基檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）;其他生化試劑均為國產(chǎn)AR級。

1.2 荷瘤小鼠腫瘤模型構(gòu)建及其脾臟和骨髓單個細(xì)胞懸液的制備 用1×PBS將處于對數(shù)生長期的LLC細(xì)胞調(diào)至密度為1×107個/ml,取0.1 ml細(xì)胞懸液皮下注射至C57BL/6J小鼠右腹背部,三周后（腫瘤長至直徑1～3厘米時）處死小鼠。取其脾臟,用磨砂玻片碾磨,然后取孔徑為200目尼龍膜過濾,1 000 r/min離心5分鐘,棄上清,加入2m l紅細(xì)胞裂解液,用吸管輕輕地吹打后靜置3分鐘,加入10%FCSRPMI1640培養(yǎng)基5m l終止紅細(xì)胞裂解反應(yīng),取尼龍膜過濾,離心洗細(xì)胞,用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度,置冰上備用;同時分離小鼠的股骨和脛骨,用5 ml一次性注射器吸取1×PBS沖洗骨髓腔,經(jīng)尼龍膜過濾、離心洗細(xì)胞后,用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度,置冰上備用。

1.3 采用密度梯度離心法初步分離MDSC 文獻(xiàn)報(bào)道MDSC的密度約為1.069,其分離方法如下:預(yù)先用100%的Percoll溶液懸浮上述脾臟和骨髓細(xì)胞,將一吸管插至15m l的離心管中,沿吸管壁依次緩緩注入各 2 ml的 PBS、50%Percoll、60%Percoll、70%Percoll和100%Percoll溶液懸浮的上述脾臟或骨髓細(xì)胞,2 900 r/min離心30分鐘,收集第二層細(xì)胞懸液（50%和60%Percoll溶液之間）,用1×PBS洗細(xì)胞兩次后,調(diào)整細(xì)胞濃度2×107ml-1,置冰上備用。這層細(xì)胞約80%為CD11b+Gr-1+MDSC。

1.4 用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟和骨髓中MDSC數(shù)量百分比 取1×106上述荷瘤小鼠脾臟、骨髓的細(xì)胞原液及經(jīng)Percoll溶液分離后的MDSC,按照抗體說明書加入FITC antiGr-1和PE antiCD11b對細(xì)胞進(jìn)行染色,同時設(shè)對照組,用流式細(xì)胞儀檢測CD11b+Gr-1+細(xì)胞的數(shù)量百分比。

1.5 采用CFSE遞減法檢測MDSC對T細(xì)胞增殖的抑制作用 CFSE是一種綠色熒光染料,可使細(xì)胞著色,并且隨著細(xì)胞的增殖,熒光逐漸減弱,直至消失。經(jīng)過CFSE染色后的T細(xì)胞會隨著細(xì)胞增殖,熒光逐漸衰減,以此推測T細(xì)胞的增殖狀況。本實(shí)驗(yàn)取正常6周齡的C57BL/6J小鼠的脾臟,按上述方法制備成5×107m l-1脾臟細(xì)胞懸液,取該細(xì)胞1m l與1m l 0.1%BSA的PBS和1μl CFSE（終濃度 5μg/m l）混勻,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30分鐘后加入1m l小牛血清終止反應(yīng),再加入9m l無血清的RPMI1640混勻,1 000 r/min離心5分鐘,棄上清,然后取無血清的RPM I1640洗細(xì)胞兩次,最后用1ml 10%FSC RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞密度至 2×107ml-1。

取上述經(jīng)CFSE染色的脾臟細(xì)胞懸液和上述經(jīng)Percoll溶液分離的MDSC各100μl（2×106）（1∶1）混合,并用100μl Ionomycin（終濃度10 ng/ml）和100μl PMA（終濃度10μg/ml）刺激其中T細(xì)胞增殖。同時設(shè)各種對照組:未加MDSC組、未加MDSC及Ionomycin和PMA組。各組最終用10%FCSRPM I1640培養(yǎng)基補(bǔ)足2ml終體積,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天,收集細(xì)胞至流式測定試管中,用PE antiCD3標(biāo)記T細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測CD3+細(xì)胞即T細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.6 采用生化方法檢測MDSC培養(yǎng)上清中NO、ROS的含量 分別采用硝酸還原酶-Griess試劑法和Fenton反應(yīng)法檢測MDSC培養(yǎng)上清中NO和ROS含量。其操作按各自試劑盒說明書進(jìn)行。取經(jīng)Percoll溶液分離的正常小鼠和荷瘤小鼠來源的MDSC 2×106于0.5ml無血清培養(yǎng)基中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時后,收集其細(xì)胞培養(yǎng)上清,其中,荷瘤小鼠來源的MDSC分別培養(yǎng)4、6、12、18、24小時后收集上清。

1.7 ELISA法檢測MDSC培養(yǎng)上清中IL-10、TGF-β的含量 采用ELISA檢測上述MDSC培養(yǎng)6小時后上清中IL-10、TGF-β的含量,其操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 MDSC在荷瘤小鼠骨髓和脾臟中聚集增多文獻(xiàn)報(bào)道在荷瘤小鼠和腫瘤病人的骨髓、脾臟中聚集有大量的MDSC。本實(shí)驗(yàn)給6周齡C57BL/6J小鼠皮下接種1×106LLC三周后,用流式細(xì)胞儀檢測也發(fā)現(xiàn)其骨髓、脾臟中Gr-1+CD11b+細(xì)胞即MDSC較正常小鼠顯著增多,并且在骨髓中增加的幅度大于脾臟。具體結(jié)果如圖1、2和3所示。圖1顯示正常小鼠骨髓中MDSC約占23.3%,而荷瘤小鼠骨髓中MDSC明顯增多,約占62.5%（P＜0.01）,經(jīng)Percoll分離純化后MDSC純度提高至79.5%。圖2顯示正常小鼠脾臟中MDSC約占22.53%;荷瘤小鼠脾臟中MDSC顯著增多,約占45.12%（P＜0.01）;經(jīng)Percoll純化后可使MDSC純度提高至62.5%。

圖1 荷瘤小鼠和正常小鼠骨髓中MDSC數(shù)量的比較Fig.1 Comparison on the number of MDSC from tumorbearing and normalmouse

圖2 正常小鼠和荷瘤小鼠脾臟中MDSC數(shù)量的比較Fig.2 Comparison on the number of MDSC from spleen of tumor-bearing and normalmouse

將骨髓和脾臟中MDSC百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后,結(jié)果如圖3所示,MDSC在荷瘤小鼠骨髓和脾臟中均聚集增多,且在骨髓MDSC聚集量比脾臟的多。

2.2 MDSC可以抑制T淋巴細(xì)胞增殖 檢測T淋巴細(xì)胞受抗原刺激后的活化和增殖,是判斷機(jī)體免疫狀況的一個重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)首先用CFSE標(biāo)記脾臟細(xì)胞后,與骨髓來源的MDSC按1∶1混合培養(yǎng),同時在該混合培養(yǎng)體系中加入Ionomycin和PMA作為T淋巴細(xì)胞的多克隆激活劑刺激T細(xì)胞增殖,以便觀察MDSC細(xì)胞對T細(xì)胞增殖的影響;培養(yǎng)5天后,用PE antiCD3單克隆抗體標(biāo)記T細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞的增殖指數(shù),結(jié)果如圖4所示:靜止T細(xì)胞的增值指數(shù)是1.07;在Ionomycin和PMA刺激下T細(xì)胞的增值指數(shù)增至5.68,而加入MDSC后,T細(xì)胞的增殖指數(shù)降為3.0（P＜0.01）,提示經(jīng)percoll分離的骨髓來源的MDSC能顯著抑制T淋巴細(xì)胞增殖。2.3 MDSC能產(chǎn)生大量的NO和活性氧（Reactive oxygen species,ROS） 有文獻(xiàn)報(bào)道,MDSC可通過產(chǎn)生NO和ROS抑制機(jī)體抗腫瘤免疫[8-13],本實(shí)驗(yàn)也比較了正常和荷瘤小鼠骨髓來源的MDSC產(chǎn)生NO和ROS的水平。首先觀察體外培養(yǎng)荷瘤小鼠來源的MDSC產(chǎn)生NO的動態(tài)變化,結(jié)果如圖5所示:荷瘤小鼠MDSC產(chǎn)生的NO在4小時即開始增高,6小時達(dá)高峰,經(jīng)過幾個小時的平臺期,在18小時時開始逐漸下降,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇6小時的時間點(diǎn)比較正常與荷瘤小鼠MDSC產(chǎn)生NO的水平,結(jié)果如圖6,荷瘤小鼠MDSC產(chǎn)生NO的量顯著高于正常小鼠來源的MDSC,分別為 264.9μmol/L和31.1 μmol/L（P＜0.01）,是正常小鼠MDSC產(chǎn)生NO的8.5倍。

圖3 正常小鼠和荷瘤小鼠脾臟和骨髓中MDSC數(shù)量的比較Fig.3 Comparison on the number of MDSC from bone marrow of tumor-bearing and normalmouse

圖4 MDSC抑制T淋巴細(xì)胞增殖Fig.4 MDSCs surp ress the proliferation of T lymphocytes

圖5 荷瘤小鼠MDSC體外產(chǎn)生NO的動態(tài)變化Fig.5 The level of NO quantity change rule in MDSC culture supernatants from tumor-bearingmouse

圖6 比較兩種來源的MDSC產(chǎn)生NO和ROS量Fig.6 Comparison on the quantity of NO and ROS from tumor-bearing and normalmouse

此外,我們同時觀察和比較了正常小鼠和荷瘤小鼠MDSC產(chǎn)生ROS的水平。結(jié)果如圖6所示,荷瘤小鼠來源的MDSC在體外培養(yǎng)6小時時ROS含量顯著高于正常小鼠來源的MDSC（P＜0.01）,約提高了1倍多。

2.4 MDSC表達(dá)IL-10、TGF-β抑制性細(xì)胞因子 為了進(jìn)一步研究MDSC抑制機(jī)體抗腫瘤免疫的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用ELISA的方法檢測了不同來源的MDSC在體外培養(yǎng)6小時后上清中IL-10、TGF-β的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)來源于荷瘤小鼠MDSC分泌的IL-10顯著高于正常小鼠的MDSC（P＜0.01）,分別為337.5 pg/m l和196.4 pg/ml,而且,TGF-β的分泌也有相同的趨勢,荷瘤小鼠MDSC分泌的TGF-β顯著高于正常小鼠的MDSC（P＜0.01）,二者分別為25 072.25 pg/ml和16 083.615 pg/ml（圖7）;提示荷瘤小鼠MDSC很有可能通過分泌IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子抑制機(jī)體的免疫功能。

圖7 比較兩種來源的MDSC產(chǎn)生IL-10和TGF-β的量Fig.7 Comparison on the quantity of IL-10 and TGF-βfrom tumor-bearing and norma lmouse

3 討論

大量的研究報(bào)道,慢性炎癥和腫瘤組織中聚集的MDSC具有很強(qiáng)的免疫抑制作用,是引起腫瘤免疫逃逸的重要細(xì)胞群體。其免疫抑制機(jī)制有:①大量產(chǎn)生誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶和精氨酸酶,通過促進(jìn)NO和活性氧產(chǎn)生而直接抑制T細(xì)胞功能[8-15];②其產(chǎn)生的精氨酸酶消耗精氨酸,導(dǎo)致TCR CD3ζ合成受阻,使T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙[12-15];③MDSC一旦浸潤腫瘤組織即可分化為TAM和血管內(nèi)皮細(xì)胞,抑制T細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能[7]。④MDSC可分泌TGF-β、IL-10等抑制性細(xì)胞因子,誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp 3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（Treg）產(chǎn)生,抑制腫瘤免疫[16-20]。

本研究也進(jìn)一步證實(shí)MDSC在荷瘤小鼠的脾臟和骨髓中聚集顯著增多,且其在骨髓中所占的比例及增高的幅度顯著高于脾臟;經(jīng)Percoll純化的、骨髓來源的MDSC（取自50%～60%界面的細(xì)胞,其MDSC純度達(dá)80%）可以明顯抑制脾臟細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞的增殖,體外培養(yǎng)6小時后可以分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β。但MDSC的免疫抑制功能與其來源有關(guān),往往只有從荷瘤小鼠和腫瘤患者體內(nèi)分離到的MDSC才具有免疫抑制功能,而用同樣的方法從正常小鼠和人體內(nèi)分離的MDSC不具有或僅有很低的免疫抑制功能[20],本實(shí)驗(yàn)也得到同樣的結(jié)論,即荷瘤小鼠來源的MDSC的免疫抑制功能顯著高于正常小鼠來源的MDSC。

MDSC高表達(dá)精氨酸酶（ARN）和一氧化氮合酶（NOS）,兩者均參與了MDSC免疫抑制作用。其具體機(jī)制如下:腫瘤微環(huán)境中左旋精氨酸（L-Arg）減少,L-A rg通過兩種酶——ARN和NOS代謝:①ARN途徑:L-Arg在ARN的作用下生成鳥氨酸和尿素。②NOS途徑:L-Arg被NOS氧化,生成一氧化氮（NO）和瓜氨酸。進(jìn)一步研究證實(shí),L-Arg是CD8+T細(xì)胞生成CD3和CD8所必須的氨基酸,L-A rg缺乏可導(dǎo)致T細(xì)胞受體（TCR）CD3ζ鏈合成受阻和TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。而CD3ζ鏈合成受阻又可通過反饋機(jī)制使細(xì)胞內(nèi)ARN生成增多,故導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)L-Arg的耗竭[12,13,21-24]。

IL-10具有很強(qiáng)的免疫抑制作用,其參與MDSC的免疫功能的機(jī)制可能包括:①IL-10能夠誘導(dǎo)未成熟的輔助性T淋巴細(xì)胞（Th0）向Th2細(xì)胞分化,抑制Th1細(xì)胞的生成。Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4、IL-6、IL-10都可直接刺激腫瘤細(xì)胞生長,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和MDSC產(chǎn)生更多的IL-10。②IL-10能抑制單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生 IL-1、IL-12、TNF-α、GM-CSF,抑制T 細(xì)胞及NK 細(xì)胞產(chǎn)生TNF-β、IFN-γ,并促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。③IL-10能抑制各種抗原遞呈細(xì)胞（APC）對抗原的趨化反應(yīng),并抑制APC膜上MHCⅠ、Ⅱ類分子及CD80、CD86等的表達(dá),從而抑制了APC向T細(xì)胞遞呈抗原[16,20,21,25-31]。

另外,荷瘤小鼠來源的MDSC產(chǎn)生大量TGF-β參與MDSC的免疫功能的機(jī)制可能包括如下:①可以促使Th1/Th2平衡向Th2細(xì)胞方向偏移。②可以抑制CTL和NK細(xì)胞CD3中ζ鏈信號的傳遞,抑制ζ鏈及細(xì)胞質(zhì)中蛋白酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化,故抑制相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的活化。③TGF-β能夠抑制IFN-γ及MHC Ⅱ類分子合成[18,20]。

總之,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)荷瘤小鼠的MDSC通過分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β抑制機(jī)體抗腫瘤免疫,同時證明荷瘤小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)Percoll分離后取其50%～60%界面的細(xì)胞可用于MDSC生物學(xué)功能的基礎(chǔ)研究,為研究腫瘤免疫逃逸機(jī)理及臨床抗腫瘤治療提供新的實(shí)驗(yàn)手段和理論依據(jù)。

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[收稿2009-03-15 修回2009-06-05]

（編輯 倪 鵬）

Study on mechanismsof immune suppression mediated bymyeloid derived suppressor cells

WANLin,HUXin,ZHAOXian-Xian,LIXiao-Yan,LIZhuo-Ya,YINBing-Jiao.InstituteofImmunology,TongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

Objective:To study themechanisms of immune suppressionmediated by Gr-1+CD11b+myeloid derived suppressor cells（Gr-1+CD11b+MDSC）from tumor-bearingmice.Methods:Gr-1+CD11b+MDSC recruited into spleen and bonemarrow of tumor-bearing micewere purified by Percoll,and suppressionmediated byMDSC on T cell proliferation from sp leen of na?vemicewas detected by flow cytometry with CSFE and FITC-anti CD3 staining,and NO,ROS,IL-10 and TGF-βin the supernatantofMDSCwere detected by Griess and ELISA.Results:There weremuchmoreGr-1+CD11b+MDSCs in spleen and bonemarrow from tumor-bearingmouse than those of na?vemouse,and suppression on T cell proliferationmediated by MDSC from tumor bearingmouse was significantly increased,and there weremuchmore NO,ROS,IL-10 and TGF-βin the supernatant of these MDSC than that from na?vemouse.Conclusion:MDSC from tumor-bearingmice secreted high level of NO,ROS,IL-10 and TGF-βto induce immune suppression,and inhibite the proliferation of T cells.

MDSC;NO;ROS;IL-10;TGF-β

R392.111

A

1000-484X（2010）01-0017-06

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30771976）

萬 琳（1982年-）,女,在讀碩士,主要從事腫瘤免疫學(xué)研究,E-mail:wanlin811002@sina.com;

及指導(dǎo)教師:尹丙姣（1964年-）,女,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤免疫學(xué)研究,E-mail:bingjiaoyin@gmail.com。