宮 強(qiáng) 牛明福 王帥濤 秦翠麗 孫曉菲 馬麗蘋 侯玉澤 （河南科技大學(xué),洛陽 471003）

禽巴氏桿菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的免疫效果①

宮 強(qiáng) 牛明福 王帥濤 秦翠麗 孫曉菲 馬麗蘋 侯玉澤 （河南科技大學(xué),洛陽 471003）

目的:研究禽多殺性巴氏桿菌omph DNA疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果。方法:利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出禽多殺性巴氏桿菌的 omph基因片段,克隆到pMD18-T上,再亞克隆到真核載體pcDNA3.1（+）上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pOMPH,體外轉(zhuǎn)染SP2/0細(xì)胞,RT-PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)、Western blot檢測其轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況。然后進(jìn)行動(dòng)物免疫,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組即:pOMPH組、pCDNA3.1（+）空載體組和PBS對照組,每組16只BALB/c小鼠,pOMPH組和 pCDNA3.1（+）組以100μg/只的劑量肌注免疫,PBS組每只小鼠肌注100μl 1×PBS,各組均進(jìn)行了三次免疫,每次間隔兩周。間接ELISA檢測免疫后小鼠血清特異性抗體水平,MTT法檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況,三免兩周后檢測脾淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌情況。強(qiáng)毒攻擊,計(jì)算小鼠存活數(shù)目及保護(hù)率。結(jié)果:間接免疫熒光試驗(yàn)、Western blot和RT-PCR檢測結(jié)果均表明pOMPH可在體外培養(yǎng)的SP2/0細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。動(dòng)物免疫后,pOMPH組免疫小鼠血清抗體水平持續(xù)上升,與pCDNA3.1（+）組和PBS組相比差異極顯著（P＜0.01）。經(jīng)提取的外膜蛋白（Omps）刺激后,pOMPH組的刺激值（SI值）與pCDNA3.1（+）組及PBS免疫組相比均差異顯著（P＜0.05）。免疫小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ極顯著高于兩對照組產(chǎn)生的IFN-γ（P＜0.01）。攻毒后pOMPH組保護(hù)率明顯高于兩對照組,可達(dá)70%。結(jié)論:成功構(gòu)建了禽多殺性巴氏桿菌omph DNA疫苗,該疫苗可誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答及較好的保護(hù)效果。

禽多殺性巴氏桿菌;omph DNA疫苗;免疫應(yīng)答;保護(hù)效果

禽多殺性巴氏桿菌病是嚴(yán)重影響我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重大疫病之一,呈世界性分布,在我國依然是常見的多發(fā)病,幾乎所有的雞群都存在該病。其傳染流行嚴(yán)重影響著我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前對于該病的控制措施,主要采用的是藥物治療,尤其是抗生素如磺胺嘧啶、鏈霉素等效果較好,但易產(chǎn)生抗藥性,且應(yīng)用時(shí)間較長時(shí)對禽體,尤其是泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生明顯毒害作用。對產(chǎn)蛋雞用后可明顯引起產(chǎn)蛋率的下降,從而大大降低了其商業(yè)價(jià)值?！胺乐赜谥巍?對于大多數(shù)傳染病來說,疫苗免疫被認(rèn)為是最佳的預(yù)防策略,對于禽巴氏桿菌病亦是如此,因此,要想有效控制該病的流行,必須研制有效的疫苗。

目前我國應(yīng)用的商品化疫苗主要有禽巴氏桿菌病弱毒活疫苗和滅活疫苗兩種,其中弱毒疫苗是我國所有禽弱毒疫苗中研究最多的一類,曾在上世紀(jì)80年代達(dá)到了研制的高峰期,但由于禽多殺性巴氏桿菌本身復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)和易變異等固有的問題,至今尚未獲得理想的弱毒疫苗?，F(xiàn)有的市售弱毒苗存在著一系列的問題,如免疫期偏短（約2～3個(gè)月）、免疫保護(hù)力偏低（約50%～75%）、局部及全身的反應(yīng)偏大,不僅造成減食和嚴(yán)重產(chǎn)蛋下降,還會(huì)造成一些死亡,以及菌株遺傳不夠穩(wěn)定等關(guān)鍵性技術(shù)問題,應(yīng)用不當(dāng)甚至?xí)鹎莼魜y的爆發(fā)[1],因此其效果并不理想。而滅活苗存在的保護(hù)率低和免疫期短的問題較弱毒苗更為嚴(yán)重,所以研制新型有效的禽巴氏桿菌病疫苗勢在必行。目前針對多殺性巴氏桿菌新型疫苗的研究主要集中在重組亞單位疫苗上[2-5],而DNA疫苗的研究相對較少一些,且主要集中在豬巴氏桿菌病的DNA疫苗上[6,7],禽多殺性巴氏桿菌DNA疫苗的研究則鮮有報(bào)道。本研究以禽多殺性巴氏桿菌主要外膜蛋白編碼基因omph為基礎(chǔ)構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pOMPH,導(dǎo)入哺乳動(dòng)物SP2/0細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)及檢測,并通過對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫指標(biāo)的測定及攻毒保護(hù)率的測定,綜合評價(jià)其免疫效果,旨在為進(jìn)一步研究禽多殺性巴氏桿菌病新型有效疫苗奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和細(xì)胞 禽多殺性巴氏桿菌C48-1菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH 5α、小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0細(xì)胞）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡BALB/c小鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、連接酶為MBI公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG為北京希凱創(chuàng)新科技有限公司;RPMI1640液體培養(yǎng)基為Sigma公司產(chǎn)品;脂質(zhì)體2000為Invitrogen公司產(chǎn)品;小鼠IFN-γELISA檢測試劑盒購自上海卓康生物科技有限公司;MTT購自上海華舜生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建 設(shè)計(jì)合成禽多殺性巴氏桿菌omph基因（1 050 bp,包括信號肽序列）引物,以C48-1菌株全基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增omph基因,回收后連接pMD18-T載體,序列測定,以KpnⅠ/EcoRⅠ雙酶切后亞克隆到真核載體pcDNA3.1（+）的相應(yīng)位點(diǎn),構(gòu)建重組質(zhì)粒pOMPH。

1.2.2 禽巴氏桿菌外膜蛋白抗血清的制備 超聲波裂解法[8]提取多殺性巴氏桿菌總外膜蛋白（Omps）,SDS-PAGE檢測分子量范圍,Bradford法測定蛋白濃度。加入礦物油乳化成疫苗免疫兔子,抗原含量為2mg/m l,每只兔注射1ml,采用背部多點(diǎn)注射,共免疫三次,每次間隔2周,采血檢測抗體效價(jià)后備用。

1.2.3 重組質(zhì)粒的瞬時(shí)表達(dá) 將SP2/0細(xì)胞傳代于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pOMPH和空載體pCDNA3.1（+）,37℃5%CO2培養(yǎng)72小時(shí)。收獲細(xì)胞以間接免疫熒光試驗(yàn)、Western blot和RT-PCR檢測其表達(dá)情況。

1.2.4 動(dòng)物免疫 6～8周齡雌性BALB/c小鼠共48只,隨機(jī)平均分為三組,分別為pOMPH組、pCDNA 3.1（+）空載體組和PBS對照組。

重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染SP2/0細(xì)胞,經(jīng)檢測表達(dá)成功后,堿裂解法大量制備質(zhì)粒pOMPH和pCDNA3.1（+）,PEG法純化,溶于 1×PBS（pH7.2）中,分光光度計(jì)測定其濃度和純度并用上述PBS調(diào)整濃度為1 μg/μl。將各組疫苗注射于小鼠大腿內(nèi)側(cè)肌肉,pOMPH組和pCDNA 3.1（+）組免疫劑量均為100 μg/只小鼠,PBS對照組每只小鼠注射100μl1×PBS（pH7.2）,共免疫三次,每次間隔兩周。

1.2.5 血清性抗體檢測 以間接ELISA測定抗體效價(jià),即免疫后每周斷尾采血,分離血清,用10μg/m l提取的外膜蛋白包被酶標(biāo)板,封閉后加入100倍稀釋的待檢血清,37℃濕盒內(nèi)作用1.5小時(shí)后加入HRP-羊抗鼠IgG作用1.5小時(shí),加入OPD暗室內(nèi)顯色10分鐘后用2mol/L硫酸終止反應(yīng),在OD490處測定吸收值以確定免疫小鼠血清抗體水平,共檢測6周。

1.2.6 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 分別于一免兩周、二免兩周和三免兩周后取兩只小鼠脫頸處死,無菌采取脾臟制備脾細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入脾細(xì)胞懸液50μl,同時(shí)設(shè)陰性對照。試驗(yàn)孔和陰性對照孔各設(shè)3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)孔每孔加入50μl20μg/m l提取的巴氏桿菌外膜蛋白,陰性對照孔每孔加入50μl RPIM1640培養(yǎng)液,置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)后,每孔加入5mg/mlMTT 10μl,繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。然后每孔加100μl SDS-Hcl,繼續(xù)作用2小時(shí)終止反應(yīng),測定OD570吸光值,計(jì)算刺激值（SI）=OD（試驗(yàn)孔）/OD（陰性對照孔）。

1.2.7 免疫小鼠IFN-γ水平的測定 三免兩周后,殺死小鼠,無菌條件下迅速取出脾臟制備脾淋巴細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml。按上述同樣方法制備Omps活化的脾淋巴細(xì)胞,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后,吸取培養(yǎng)上清離心收集后-20℃保存。按照IFN-γ檢測試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,對免疫小鼠脾細(xì)胞分泌的IFN-γ進(jìn)行檢測。

1.2.8 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 三免后兩周,各組小鼠腹腔注射禽多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒C48-1菌株進(jìn)行攻毒,5 LD50/只,觀察10天,記錄各組小鼠死亡數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的體外表達(dá) 通過提取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和空載體的細(xì)胞總RNA,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染有pOMPH的細(xì)胞中擴(kuò)增出了大小約為1 050 bp的基因片段,而空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未擴(kuò)增出相應(yīng)片段（圖1A）,說明目的基因在真核細(xì)胞中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。間接免疫熒光分析結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pOMPH的細(xì)胞在倒置顯微鏡下可見到綠色熒光,而空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無熒光出現(xiàn)（圖1B、C）;Western blot分析顯示重組質(zhì)粒pOMPH轉(zhuǎn)染的SP2/0細(xì)胞泳道約38 kD處出現(xiàn)陽性條帶,而空載體pcDNA3.1（+）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞泳道中無該特異性條帶出現(xiàn)（圖1D）。以上結(jié)果表明禽多殺性巴氏桿菌omph基因能通過體外轉(zhuǎn)染途徑進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)目的蛋白。

2.2 ELISA抗體檢測 以提取的外膜蛋白為包被抗原進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)檢測免疫小鼠血清特異性抗體水平,結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知,pOMPH組免疫小鼠抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加逐漸上升,從一免后三周開始與兩對照組差異極為顯著（P＜0.01）,而PBS組和pCDNA 3.1（+）組小鼠血清抗體水平始終保持在較低水平,兩者之間差異不顯著（P＞0.05）,此結(jié)果表明重組質(zhì)粒pOMPH免疫后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。

2.3 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果 每次免疫后兩周,制備免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液,MTT法檢測其增殖情況,結(jié)果如圖3所示。一免后pOMPH組的SI值明顯高于PBS和pCDNA3.1（+）對照組（P＜0.05）,二免和三免后DNA疫苗組SI值則極顯著高于兩對照組（P＜0.01）。

圖1 omph基因轉(zhuǎn)染 SP2/0細(xì)胞的RT-PCR鑒定（A）、免疫熒光檢測（B、C）和W estern blot分析（D）Fig.1 The Results of RT-PCR（A）,indirect immunofluorescent test（B&C）,W estern b lot ana lysis（D）of exp ression p rotein

圖2 血清抗體水平Fig.2 The dynam ic changes of serum antibody

圖3 淋巴細(xì)胞增殖情況（SI,±s）Fig.3 The lymphocytes proliferation in m ice（SI,±s）

圖4 脾淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌水平Fig.4 The level of specific IFN-γsecred by splenic lymphocy tes induced with OMPs

表1 攻毒試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Protection of immunized mice against lethal challenge with Pasteurellamuhocida

2.4 IFN-γ分泌水平 三免兩周后,同樣制備脾淋巴細(xì)胞懸液,以提取的外膜蛋白Omps進(jìn)行誘生,收集上清,檢測上清中IFN-γ的量,結(jié)果如圖4所示。IFN-γ分析結(jié)果表明,經(jīng)omps誘生后pOMPH組分泌的IFN-γ含量約為809 pg/m l,明顯高于兩對照組（P＜0.01）,兩對照組之間則無明顯差異（P＞0.05）。

2.5 攻毒試驗(yàn)結(jié)果 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于三免后兩周以多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊。十天后,pOMPH組僅有少數(shù)小鼠死亡,而pCDNA3.1（+）組和PBS組小鼠幾乎全部死亡,各組存活數(shù)及保護(hù)率如表1所示。

3 討論

禽多殺性巴氏桿菌病作為影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的重要疫病之一,近些年來已越來越受到人們的重視。目前市售商品化疫苗存在一定的缺陷,導(dǎo)致免疫失敗的現(xiàn)象屢見不鮮,為提高免疫保護(hù)效果,勢必要研制更為有效的新型疫苗。DNA疫苗是上世紀(jì)九十年代后發(fā)展起來的新型疫苗,具有制備方便、免疫力持久、副作用少等優(yōu)點(diǎn),因此成為人們研究的熱點(diǎn)。

構(gòu)建DNA疫苗的關(guān)鍵在于選取有效的保護(hù)性抗原基因。研究表明外膜蛋白（Omps）編碼基因?yàn)橹虏【饕拿庖咴蛑?。Omps對細(xì)菌致病機(jī)理和免疫作用機(jī)理的探討已經(jīng)越來越受到人們的重視,通過對其的深入研究有助于揭示Omps誘發(fā)保護(hù)反應(yīng)的機(jī)理及其在誘發(fā)免疫應(yīng)答時(shí)與免疫細(xì)胞的相互作用,并為確定Omps的有效最小抗原結(jié)構(gòu)及研制相應(yīng)的疫苗奠定基礎(chǔ)。Confer等[9]用多殺性巴氏桿菌接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,刺激其產(chǎn)生抗多殺性巴氏桿菌Omps的抗體,并用ELISA方法檢測其效價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6種Omps血清抗體與抵抗攻毒有關(guān),并可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和活化補(bǔ)體,抑制細(xì)菌與宿主的粘附,提示Omps在保護(hù)多殺性巴氏桿菌感染方面有著重要的作用。

多殺性巴氏桿菌Omps包括主要蛋白和微量蛋白兩種,兩者在細(xì)胞中的拷貝數(shù)含量差別較大。主要蛋白包括外膜A蛋白（OmpA）、外膜蛋白H（OmpH）等。OmpH是多殺性巴氏桿菌最主要的微孔蛋白,也是多殺性巴氏桿菌的一種保護(hù)性抗原,免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明OmpH蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的免疫應(yīng)答[10-12]。Luo等克隆了OmpH蛋白編碼基因,試驗(yàn)顯示它具有微孔蛋白活性,用重組的OmpH免疫試驗(yàn)動(dòng)物,其保護(hù)率幾乎為100%,與全菌誘導(dǎo)的保護(hù)率相當(dāng),進(jìn)一步的研究表明,來源于不同血清型的OmpH蛋白具有高度的同源性,因此其具有交叉保護(hù)性[13]。由此可見,以禽多殺性巴氏桿菌OmpH構(gòu)建的疫苗有望為禽類提供較好的保護(hù)效果。

機(jī)體對抗多殺性巴氏桿菌感染的過程中,體液免疫應(yīng)答具有至關(guān)重要的作用,重組亞單位疫苗由于可誘導(dǎo)較高水平的抗體應(yīng)答,因此過去人們主要致力于此類疫苗的研究。然而,目前已知細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗多殺性巴氏桿菌免疫中也具有舉足輕重的作用,而DNA疫苗則可有效地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)對pOMPH DNA疫苗免疫后誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明該DNA疫苗可刺激產(chǎn)生較高水平的免疫應(yīng)答。攻毒試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明該疫苗可為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供一定的保護(hù)力。因此,以外膜蛋白H編碼基因構(gòu)建的DNA疫苗在抗禽多殺性巴氏桿菌病方面表現(xiàn)出了一定的應(yīng)用前景。

本研究成功構(gòu)建了禽多殺性巴氏桿菌omph DNA疫苗pOMPH,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該疫苗可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,并可為免疫小鼠提供較高的保護(hù)率,從而為禽巴氏桿菌病新型疫苗的研究提供了一定的理論依據(jù)。

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[收稿2009-09-17 修回2009-11-04]

（編輯 張曉舟）

The immune efficacy ofOmpH DNA vaccine from avian Pasteurellamultocida

GONGQiang,NIUMing-Fu,WANGShuai-Tao,QINCui-Li,SUNXiao-Fei,MALi-Ping,HOUYu-Ze.HenanUniversityofScience&Technology,Luoyang471003,China

Objective:To research on protective immunity of omph DNA vaccine against avian Pasteurella multocida in mice.Methods:The omph gene fragmentamplified by PCR from avian Pasteurellamultocida was cloned into pMD18-T.Subsequently itwas subcloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1（+）,and the recombinant p lasmid pOMPHwasobtained.Then the recombinantplasmid was transfected into SP2/0 cells in vitro.The transcription and expression of targetgene were analyzed by RT-PCR,Western blot analysis and indirect immunofluorescence.Three groups of BALB/cmice（n=16）named pOMPH,pCDNA3.1（+）and PBSwere intramuscu larly vaccinated with the recombinant plasm id,control vector and PBS respectively.The serum antibodies were detected by indirect ELISA.The spleen lymphocyte proliferation（SLP）and secreted IFN-γof spleenwere tested byMTT.Them icewere challenged with virulentofavian Pasteurellamultocida on week 2 post the third immunization,the protection ratewere counted.Results:RT-PCR,Western blotanalysis and indirect immunofluorescence showed that the omph gene could be transfected into SP2/0 cells in vitro and expressed the targetprotein.Indirect ELISA showed that the levels of antibodiesin pOMPH group weremost significantly higher than in theothergroups（P＜0.01）.Spleen lymphocyte p roliferationbyMTTassay indicated that the SIvalue inducedwith avian Pasteurellamultocida Ompsin pOMPH groupwashigher than those in pCDNA3.1（+）and PBS groups（P＜0.05）.The IFN-γexperiments（Double-antibodies-sandwich-ELISA）showed that the levels of IFN-γinduced with Omps in the group of pOMPHwasmostly higher than in theother controlgroups apperent（P＜0.01）.The protection rateof pOMPH（70%）was better than in the othergroups.Conclusion:The omph DNA vaccine against avian Pasteurellamultocida had been constructed successfu lly.The DNA vaccine could enhance the immunity level and the protective effectof the vaccinatedmice.Presentstudymay be useful for the developmentof avian Pasteurellamultocida vaccine.

avain Pasteurellamuhocida;omph DNA vaccine;Immune response;Protective effect

S855.1

A

1000-484X（2010）01-0013-05

①本文為河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（092102110162）

宮 強(qiáng)（1979年-）,男,博士,講師,碩士生導(dǎo)師,主要從事獸醫(yī)分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究,E-mail:qianggong79@yahoo.com.cn。

·腫瘤免疫學(xué)·