孔琳，潘伯臣，杜強(qiáng)，楊大磊

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，沈陽(yáng) 110004）

精子發(fā)生障礙患者Y染色體微缺失的檢測(cè)

孔琳，潘伯臣，杜強(qiáng)，楊大磊

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，沈陽(yáng) 110004）

目的 探討Y染色體微缺失與精子發(fā)生障礙患者染色體核型、臨床表型、性激素水平等因素的關(guān)系。方法 采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)42例非梗阻性無(wú)精子癥及39例嚴(yán)重少精子癥患者的SRY基因、ZFY基因及AZFa、AZFb和AZFc3個(gè)區(qū)域的6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)。結(jié)果 81例非梗阻性無(wú)精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者中發(fā)現(xiàn)了10例微缺失，發(fā)生率12.35%，其中非梗阻性無(wú)精子癥患者6例，嚴(yán)重少精子癥患者4例；10例微缺失患者中，1例為AZFa+AZFb+AZFc區(qū)缺失，2例為AZFb+AZFc區(qū)缺失，1例為AZFb區(qū)缺失，6例為AZFc區(qū)缺失。結(jié)論 Y染色體長(zhǎng)臂微缺失與精子發(fā)生障礙相關(guān)，有必要對(duì)非梗阻性無(wú)精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)。

男性不育；無(wú)精子因子；Y染色體微缺失；多重聚合酶鏈反應(yīng)；無(wú)精子癥；嚴(yán)重少精子癥

全世界大約有15%的夫婦不育，其中男性不育約占40%～50%，因此男性不育越來(lái)越引起廣泛重視［1］。精子發(fā)生障礙是男性不育的一個(gè)重要病因，可由多方面因素引起，例如疾病、內(nèi)分泌紊亂、遺傳因素、環(huán)境因素等。但目前大約60%患者中睪丸生精功能下降的原因人們還未確切了解。

近十幾年來(lái)的研究表明，Y染色體上存在著一些精子發(fā)生調(diào)控基因，即無(wú)精子因子（azoospermia factor，AZF），AZF缺失引起的生精障礙是導(dǎo)致男性不育的重要原因。本研究采用多重PCR，對(duì)非梗阻性無(wú)精子癥和重度少精子癥患者進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)，分析AZF缺失類(lèi)型與患者臨床表型之間的關(guān)系，以期為AZF缺失相關(guān)男性不育的臨床診斷和治療提供有益資料和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

81例患者均為2006年3月至2007年10月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院輔助生殖中心門(mén)診就診的患者，年齡23～40歲。詳細(xì)了解患者有無(wú)睪丸炎、腮腺炎、精索靜脈曲張等病史，排除梗阻性無(wú)精子癥，所有患者均無(wú)有毒物質(zhì)及放射線接觸史。按WHO（1999）的診斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行2次以上的精液常規(guī)分析，將患者分為外梗阻性無(wú)精子癥（42例）和嚴(yán)重少精子癥（精子密度＜5×106/ml，39例）。所有患者均排除常染色體核型異常，其中2例染色體核型為46，XY（大 Y），1例為 46，XY（小 Y）。所有患者均在上午8：00～10：00靜脈采血進(jìn)行血清性激素測(cè)定，包括卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和睪酮（testosterone，T）。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提?。撼槿∈茉噷?duì)象靜脈血2 ml，EDTA抗凝。所有樣本的DNA用杭州博日科技有限公司的Biospin全血基因組DNA提取試劑盒提取。提取的DNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度并計(jì)算DNA濃度。

1.2.2 引物：確定Y染色體AZF區(qū)域內(nèi)的6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)（sequence tag site，STS），分別是AZFa區(qū)的sY86（320bp） 和 sY84（326bp）、AZFb區(qū)域內(nèi)的sY127（274bp）和 sY134（301bp）、AZFc區(qū)域內(nèi)的sY254（400bp）和 sY255（126bp）。6對(duì)引物均由Invitrogen公司所合成。引物序列均已發(fā)表［2］。

1.2.3 質(zhì)控：設(shè)立ZFY及SRY基因作為內(nèi)對(duì)照，其引物序列已發(fā)表［2］。同時(shí)設(shè)立已生育的正常男性為陽(yáng)性對(duì)照、正常女性作為陰性對(duì)照、水作為空白對(duì)照。每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)需做2個(gè)多重PCR反應(yīng)。為排除假陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)發(fā)現(xiàn)有微缺失的標(biāo)本進(jìn)行3次多重PCR檢測(cè)，如果上述缺失仍無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，而SRY和ZFY均能正常擴(kuò)增，則證實(shí)微缺失的存在；必要時(shí)，使用相應(yīng)引物進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增予以確認(rèn)。

1.2.4 PCR檢測(cè)：PCR反應(yīng)總體系為 20μl，包括去離子水、緩沖液、dNTP、DNA聚合酶及模板。按下列條 件 擴(kuò) 增 ：94℃ ，4min；95℃ ，1min；56℃ ，1min；72℃，1min；共 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 7min，最后置4℃保溫。

1.2.5 電泳檢測(cè)：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7μl，加10×loading buffer 1μl，在3.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察分析。Y染色體微缺失者相應(yīng)條帶的PCR產(chǎn)物闕如。

1.2.6 DNA測(cè)序：所有PCR產(chǎn)物均經(jīng)北京華大公司進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)了檢測(cè)結(jié)果的特異性。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR電泳所示Y染色體微缺失檢測(cè)結(jié)果

81例患者中10例患者檢測(cè)到微缺失，總發(fā)生率為12.35%。其中，42例非梗阻性無(wú)精子癥中有6例存在微缺失，發(fā)生率為14.29%；39例嚴(yán)重少精子癥患者中4例檢測(cè)到微缺失，發(fā)生率為10.26%。10例微缺失患者中，1例為AZFa+AZFb+AZFc區(qū)（占總?cè)笔?0.00%），2例為AZFb+AZFc區(qū)（占總?cè)笔?20.00%），1例為AZFb區(qū)（占總?cè)笔?0.00%），6例為AZFc區(qū)（占總?cè)笔?0.00%）。見(jiàn)圖1。

如果多重PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性（即有缺失），我們通常使用相應(yīng)引物進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增予以確認(rèn)，以排除假陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目的條帶為sY225的擴(kuò)增產(chǎn)物（126bp）。見(jiàn)圖2。

2.2 Y染色體微缺失患者AZF缺失類(lèi)型及其表型

在臨床表型的調(diào)查中，失訪或拒絕提供染色體及睪丸大小等資料患者4人。其余6例微缺失患者中，4例睪丸體積小于正常值（12ml），1例患有隱睪及鞘膜積液，1例患有左精索靜脈曲張和左側(cè)睪丸鞘膜積液。6例AZF缺失患者的內(nèi)分泌激素平均值分別為FSH19.42mIU/ml（參考值1.27～19.26mIU/ml），LH5.38mIU/ml（參考值 1.24～8.62mIU/ml），T3.74ng/ml（參考值1.75～7.81ng/ml）。81例患者中，2例染色體核型為46，XY（大Y），均未見(jiàn)缺失；1例染色體核型為46，XY（小Y）的患者AZFb+AZFc區(qū)缺失。具體臨床表型見(jiàn)表1。

3 討論

表1Y染色體微缺失患者AZF缺失類(lèi)型及其臨床表型Ta b.1Cl i n i c a l f e a t h u r e a n d AZFd e l e t i o n p h e n o t y p e s o f t h e p a t i e n t s w i t h Yc h r o mo s o me mi c r o d e l e t i o n No.Azoo/Oligo Testis volume Chromosome FSH LH T Deletion left/right（ml）karyotype（mIU/ml）（mIU/ml）（ng/ml）type 2 Azoo - 46，XY - - - AZFc 8 Oligo 6/6 46，XY 12.69 9.00 3.25 AZFc 27 Oligo Hydrocele testis 46，XY 33.76 7.02 4.59 AZFc 56 Oligo 7/6 46，XY 8.11 2.57 2.23 AZFc 60 Oligo - 46，XY - - - AZFc 65 Azoo 8/10 46，XY 11.73 3.46 3.75 AZFc 34 Azoo - 46，XY - - - AZFb 80 Azoo 6/6 46，XY（short Y） 33.04 6.44 3.78 AZFb+AZFc Normal size 82 Azoo left varicocele 46，XY 17.23 3.78 4.85 AZFb+AZFc Left hydrocele testis 55 Azoo - 46，XY - - - AZFa+AZFb+AZFc Oligo，severe oligospermia；Azoo，azoospermia.

1976 年，Tiepolo和Zuffardi發(fā)現(xiàn)在無(wú)精子癥患者中存在顯微鏡下可見(jiàn)的Y染色體長(zhǎng)臂的缺失，推測(cè)Y染色體長(zhǎng)臂上可能存在著控制精子生成的基因，并稱(chēng)其為AZF。隨著分子生物學(xué)及遺傳學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，人們對(duì)AZF結(jié)構(gòu)、功能以及與男性不育之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)逐漸加深。1986年，Vergnaud初步建立了人類(lèi)Y染色體缺失圖譜；1996年，Voget等將AZF劃分為3個(gè)無(wú)重疊區(qū)域，分別命名為AZFa、AZFb和AZFc；2002年，Repping又提出新的AZFb和AZFc分區(qū)與缺失模型［3］。

近十幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外很多實(shí)驗(yàn)室都相繼開(kāi)展了關(guān)于Y染色體微缺失的檢測(cè)。Y染色體AZF總的缺失率在不同國(guó)家、不同種族之間存在明顯差異，從1%～55%不等［4］。周友泉等總結(jié)中國(guó)無(wú)精癥和少精癥Y染色體微缺失的總?cè)笔蕿?5.05%［5］。AZF不同區(qū)域的缺失率也不盡相同，其中AZFc區(qū)缺失率最高，AZFa區(qū)缺失率最低。在研究對(duì)象的選擇上，大部分學(xué)者都集中在對(duì)原發(fā)性無(wú)精子癥及少精子癥進(jìn)行研究，有的實(shí)驗(yàn)室則專(zhuān)門(mén)對(duì)準(zhǔn)備接受胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù) （intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療的不育患者進(jìn)行檢測(cè)。綜合來(lái)看，AZF缺失率的差異主要與研究對(duì)象的選擇、STS位點(diǎn)的選擇與數(shù)量、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的規(guī)范性等因素有關(guān)。近年來(lái)，Simoni等提出的多重PCR檢測(cè)方案受到歐洲男科學(xué)協(xié)會(huì)和歐洲分子遺傳實(shí)驗(yàn)質(zhì)控協(xié)作網(wǎng)的推薦，得以廣泛應(yīng)用；該法被認(rèn)為可檢出95%以上的Y染色體微缺失［2］。本研究采用該方法，并對(duì)多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序確認(rèn)。在此基礎(chǔ)上，我們檢測(cè)了81例非梗阻性無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者，發(fā)現(xiàn)這組人群中AZF缺失總的發(fā)生率為12.35%。其中，非梗阻性無(wú)精子癥患者中微缺失的發(fā)生率為14.29%；嚴(yán)重少精子癥患者中微缺失的發(fā)生率為10.26%。就缺失類(lèi)型而言，最多見(jiàn)的是AZFc區(qū)缺失，占60%；其次為AZFb+AZFc區(qū)缺失，占20%；其余類(lèi)型為AZFa+AZFb+AZFc區(qū)和AZFb區(qū)，各占10%，檢測(cè)結(jié)果與國(guó)內(nèi)外大部分研究報(bào)道的相似。

Y染色體微缺失類(lèi)型與臨床表型的關(guān)系尚不完全清楚。目前認(rèn)為，AZFa缺失導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征；AZFb或AZFb+AZFc的缺失導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征或生精阻滯。以上類(lèi)型缺失臨床上均表現(xiàn)為無(wú)精子，睪丸中也無(wú)精子存在，因此，不推薦患者進(jìn)行睪丸取精或ICSI治療。而AZFc缺失的患者臨床表現(xiàn)多樣，從無(wú)精子到嚴(yán)重少精子，甚至接近正常精子數(shù)；而且，無(wú)精子癥患者的睪丸內(nèi)仍有發(fā)現(xiàn)精子的可能，可通過(guò)ICSI助孕獲得后代，但AZFc區(qū)缺失也將同時(shí)遺傳給其男性后代［2］。本研究結(jié)果中，1例AZFa+AZFb+AZFc、2例AZFb+AZFc及 1例AZFb區(qū)缺失的患者均表現(xiàn)為無(wú)精子癥，而AZFc區(qū)缺失的6例患者中2例表現(xiàn)為無(wú)精子癥，4例表現(xiàn)為嚴(yán)重少精子癥，支持上述研究結(jié)論。

染色體 46，XY（大 Y）及 46，XY（小 Y）曾被認(rèn)為是染色體正常核型的變異。但近年來(lái)大Y及小Y染色體對(duì)生殖方面的影響已經(jīng)越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注。Nagvenkar等研究了88位欲行ICSI治療的不育患者，檢測(cè)出染色體變異率為37.5%，其中小Y染色體是性染色體變異的最常見(jiàn)類(lèi)型［1］。黃海燕等總結(jié)了117例大小Y染色體臨床病例，認(rèn)為Y染色體的變異均會(huì)不同程度地影響臨床表現(xiàn)［6］。Blanco等認(rèn)為Y染色體長(zhǎng)臂DNA序列的重復(fù)復(fù)制會(huì)影響其有關(guān)精子分化和發(fā)育的基因正常表達(dá)，造成精子受精障礙或影響精子受精能力而導(dǎo)致流產(chǎn)頻率增高［7］。大Y染色體可能是由于其異染色質(zhì)區(qū)DNA過(guò)度重復(fù)而影響生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)染色體配對(duì)聯(lián)會(huì)，使受精卵分化、分裂異常；而小Y染色體則可能是由于Y染色質(zhì)部分或完全丟失或排列過(guò)度緊密而影響其基因的功能發(fā)揮［6］。本研究中，2例染色體核型 46，XY（大 Y）患者均未見(jiàn)缺失，而 1例 46，XY（小Y）患者為AZFb+AZFc區(qū)缺失，提示小Y導(dǎo)致精子生成障礙可能與Y染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端的部分基因缺失有關(guān)。但本研究病例數(shù)較少，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

目前我國(guó)很多生殖中心都相繼開(kāi)展了Y染色體微缺失的檢測(cè)項(xiàng)目。這項(xiàng)檢測(cè)既為男性不育癥提供了重要的病因?qū)W線索，又為非梗阻性無(wú)精子癥患者睪丸穿刺或活檢獲取精子的結(jié)局提供一定的預(yù)測(cè)，從而使患者避免了不必要的手術(shù)創(chuàng)傷和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。同時(shí)，由于開(kāi)展了Y染色體微缺失檢測(cè)項(xiàng)目，我們能夠?yàn)橐恍┗颊咛峁﹤€(gè)性化咨詢(xún)與治療。例如，有研究表明，AZFc缺失的患者可能出現(xiàn)精子數(shù)量隨時(shí)間進(jìn)行性減少的現(xiàn)象［8］；對(duì)這樣的患者應(yīng)該指導(dǎo)盡早接受治療促其配偶懷孕，或采取凍存精子的方法以備將來(lái)的不育治療。此外，AZF缺失檢測(cè)還可以和種植前遺傳學(xué)診斷等方法結(jié)合起來(lái)，避免AZF缺失患者將遺傳缺陷傳給其后代。

［1］Nagvenkar P，Desai K，Hinduja I，et al.Chromosomal studies in infertile men with oligozoospermia and non-obstructive azoospermia［J］.Indian JMed Res，2005，122（1）：34-42.

［2］Simoni M，Bakker E，Krausz C.EAA/EMQNbest practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions，State of the art 2004［J］.Int JAndrol，2004，27（4）：240-249.

［3］Repping S，Skaletsky H，Lange J，et al.Recombination between palindromesP5andP1onthehumanYchromosomecausesmassivedeletions and spermatogenic failure［J］.Am JHum Genet，2002，71（4）：906-922.

［4］Mittal RD，Singh G，Srivastava A，et al.Ychromosome micro-deletions in idiopathic infertility from Northern India ［J］.Ann Genet 2004，47（4）：331-337.

［5］周友泉，王厚照，劉芳，等.男性不育患者Y染色體AZF區(qū)域微缺失的 STS位點(diǎn)分析［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2006，13（14）：2432-2434.

［6］黃海燕，張香改，高羽，等.117例大小Y染色體臨床意義分析［J］.中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2007，136（2）：105-107.

［7］Blanco P，Shlumukova M，Sargent CA，et al.Divergent outcomes of intrachromosomal recombination on the human Ychromosome：male infertility and recurrent polymorphism ［J］.JMed Genet，2000，37（10）：752-758.

［8］Vogt PH.Genomic heterogeneity and instability of the AZFlocus on the human Ychromosome［J］.Mol Cell Endocrinol，2004，224（1-2）：1-9.

（編輯 陳 姜，英文編輯 鄭華川）

Detection of YChromosomal Microdeletions in Patients with Spermatogenic Failure

KONGLin，PANBo-chen，DUQiang，YANGDa-lei
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the relationship between Ychromosomal microdeletions and chromosome karyotype，clinical phenotypes and sex hormone levels in patients with spermatogenic failure.MethodsSRYgene，ZFYgene and 6sequence-tagged-sites inAZFa，AZFbandAZFcwere detected with multiplex polymerase chain reaction in 42non-obstructive azoospermic and 39severe oligozoospermic men.ResultsTen cases（12.35%）of microdeletions were found in 81non-obstructive azoospermic（6cases）or severe oligozoospermic patients（4cases）.Among the 10patients with Ychromosomal microdeletions，1had deletion ofAZFa+AZFb+AZFc，2AZFb+AZFc，1AZFband 6AZFc.ConclusionMicrodeletions in the long arm of Ychromosome were associated with spermatogenic failure.Screening for Ychromosomal microdeletions in azoospermic or severe oligozoospermic patients should be of necessity and significance.

male infertility；azoospermia factor；Ychromosomal microdeletions；multiplex PCR；azoospermia；severe oligozoospermi

R711.6

A

0258-4646（2010）01-0037-03

孔琳（1982-），女，醫(yī)師，碩士.

潘伯臣，E-mail：panpancmu@yahoo.com.cn

2009-07-01