楊濱，蔡敏，閻華，鄒華偉，楊帆，劉淵

（1.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.遼寧省計劃生育科學(xué)研究院 附屬醫(yī)院，沈陽 110031）

5-FU和放射線聯(lián)合應(yīng)用對人子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響

楊濱1，蔡敏1，閻華2，鄒華偉1，楊帆1，劉淵1

（1.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.遼寧省計劃生育科學(xué)研究院 附屬醫(yī)院，沈陽 110031）

目的 研究5-氟尿嘧啶（5-FU）和放射線聯(lián)合應(yīng)用對人子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響。方法 將人子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞分為單純5-FU化療組、單純放射線組、放化療聯(lián)合組（5-FU和放射線聯(lián)合應(yīng)用組）及空白對照組4組。應(yīng)用MTT法篩選5-FU作用于人子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞的藥物濃度（48h IC50）；經(jīng)AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析；用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞經(jīng)作用后凋亡的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 單純化療、單純放療及放化療聯(lián)合都可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，放化療聯(lián)合組與單純化療和單純放療組比較可明顯增加HeLa細(xì)胞凋亡率（P<0.05）。結(jié)論 5-FU和放射線聯(lián)合應(yīng)用可明顯增加人子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞的凋亡，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

5-氟尿嘧啶；放射線；HeLa細(xì)胞；凋亡

子宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，雖然其總體發(fā)病率及死亡率呈下降趨勢，但子宮頸腺癌的發(fā)病率近年來明顯增加，世界范圍內(nèi)的檢出率已達(dá)10%～22%［1］。宮頸癌傳統(tǒng)治療主要以手術(shù)和放療為主［2］，可使部分患者得到根治或緩解，但子宮頸腺癌單純手術(shù)或放療后仍易短期內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，且對化療又不敏感，故預(yù)后不良。近年來有報道［3～5］新輔助化療（即術(shù)前或放療前的化療）和同步放化療等一些新的治療手段，可減少病灶的體積，消除亞臨床轉(zhuǎn)移，提高手術(shù)或放療的效果，化療與放療的聯(lián)合已成為腫瘤治療方面的研究重點(diǎn)。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）作為一種抗代謝類抗腫瘤藥物，已被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療，也是子宮頸癌新輔助化療的常用藥物之一，并且還有一定的放射增敏效果［6］。另外，5-FU還是新型口服型氟尿前體類藥物卡培他濱（capecitabine，CAP）在體內(nèi)選擇性發(fā)揮抗腫瘤作用的活性成份［7］。因此本文通過檢測細(xì)胞凋亡探討了5-FU和放射線（radiotherapy，RT）聯(lián)合在人子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞株中的應(yīng)用效果，以期為應(yīng)用卡培他濱與放療聯(lián)合治療子宮頸腺癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和試劑

人子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞株由盛京醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；RPMI1640培養(yǎng)基為海克隆生物制品有限公司產(chǎn)品；胎牛血清為天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為北京夏斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）和碘化丙錠為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；5-FU為上海旭東海普藥業(yè)公司產(chǎn)品。

1.2 主要設(shè)備和儀器

垂直單向流潔凈工作臺（青島海爾特種電冰柜有限公司，型號 HRLD-ZD）；解剖顯微鏡（Olympus）；倒置顯微鏡（Olympus）；CO2培養(yǎng)箱（GASINCUBATORTE-HERWATEER-JACKETHIRASAWA）；冰箱（Haier）；低溫離心機(jī)；高壓滅菌器（LDZX-40BⅠ型上海申安醫(yī)療器械廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（101-3-BS-Ⅱ型上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；自動酶標(biāo)讀數(shù)儀（Tanon Gis-1000Labsystems Dragon Wellscan MK3）；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur美國BD公司）；熒光顯微鏡（Olympus）；X線瓦里安直線加速器2300C/DSN（293美國CLINA）。

1.3 方法

1.3.1 HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)：HeLa細(xì)胞株單層貼壁培養(yǎng)于含 10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周傳代2次，實(shí)驗(yàn)時用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3.2 MTT法檢測5-FU處理HeLa細(xì)胞48h的50%抑制濃度（inhibitory concentration 50，IC50）：收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，每孔 200μl，5000～10000個細(xì)胞/孔。置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。更換新鮮培養(yǎng)液后加入5-FU處理細(xì)胞，終濃度分別為250，125，62.5，31.3，15.6，7.8，3.9，2.0，1.0和 0.5μg/ml，每個劑量設(shè)6個重復(fù)孔，同時設(shè)空白對照組（未加藥物），繼續(xù)培養(yǎng) 48h。每孔加入 20μl MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后吸掉上清，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光度值。增殖抑制率（%）＝（對照組OD值-加藥組OD值）/對照組OD值×100，作出增殖抑制率曲線，以此找到5-FU處理HeLa細(xì)胞48h的IC50。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測HeLa細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，按1×106/ml將單細(xì)胞懸液2ml接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、單純5-FU組、單純放射線組及5-FU+放射線聯(lián)合組4組。更換新鮮培養(yǎng)液，空白對照組不進(jìn)行任何處理；單純5-FU組分別加入根據(jù)MTT法所選出的大于及等于IC50的2種濃度的5-FU。單純放射組放射線的照射取2Gy、6Gy 2個劑量；5-FU+放射線聯(lián)合組先進(jìn)行放射線的照射，后根據(jù)分組情況分別加入大于或等于IC50濃度的5-FU。每組均設(shè)3個重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24，48h后，離心收獲細(xì)胞。以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，采用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的annexinⅤ和碘化丙錠染色，置于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

1.3.4 熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)：取對數(shù)生長期子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞，制成濃度為2.5×105/ml的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液按2ml/孔加至放有蓋玻片的6孔板內(nèi)，使每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)為5×105個。將細(xì)胞于蓋玻片上生長24h后更換新鮮培養(yǎng)液，與前述方法相同分組，每組均設(shè)3個重復(fù)孔，各組應(yīng)用與前述同等濃度及劑量的5-FU、放射線及5-FU+放射線聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。繼續(xù)培養(yǎng)24及48h后，用PBS洗滌2次。在 500μl的 Binding buffer中加入 10μl annexinⅤ-FITC、5μl Propidium Iodide混勻。將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋。避光、室溫反應(yīng)5min。將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察。annexinⅤ-FITC熒光信號呈綠色，碘化丙錠熒光信號呈紅色。1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS13.0進(jìn)行處理，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測5-FU48h IC50

不同濃度5-FU處理HeLa細(xì)胞48h的增殖抑制率曲線見圖1，可見細(xì)胞增殖抑制率隨藥物濃度增加而增加。當(dāng)濃度為250μg/ml和125μg/ml時，細(xì)胞抑制率≥50%，與空白組比較P<0.05，即5-FU處理HeLa細(xì)胞48h的 IC50為125μg/ml。故確定125μg/ml和 250μg/ml作為單純化療組的投藥濃度。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測HeLa細(xì)胞凋亡的變化

表1顯示各組HeLa細(xì)胞凋亡率隨時間變化的情況?？梢娮饔?4h時，放化療聯(lián)合組均比其相應(yīng)劑量的單純放療或單純化療組凋亡細(xì)胞率高（P<0.01）；125μg/ml 5-FU+6Gy 放射的聯(lián)合組所誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞最多；聯(lián)合組中125μg/ml濃度的5-FU與2Gy或6Gy放射聯(lián)合投予，均比濃度為250μg/ml 5-FU與2Gy或6Gy放射聯(lián)合投予時所誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞多（P<0.05）。作用48h時，放化療聯(lián)合組凋亡細(xì)胞率均低于其相應(yīng)劑量的單純化療組但高于其相應(yīng)劑量的單純放療組（P<0.01）。

表15-FU、放射線、5-FU＋放射線聯(lián)合組誘導(dǎo)He La細(xì)胞凋亡百分率（±s，%）Fi g.1Th e a p o p t o t i c r a t e o f He La c e l l s i n d u c e d b y 5-FU，RTa n d RTc o mb i n e d w i t h 5-FU（±s，%）The apoptosis of HeLa cells 24h 48h Control 6.38±0.70 6.97±0.155-FU 125μg/ml 11.56±0.291） 0.41±0.221）250μg/ml 12.52±0.451） 35.56±0.361）RT 2Gy 14.09±0.631） 21.51±0.581）6Gy 59.24±0.941） 7.69±0.081）5-FU＋RT 125μg/ml+2Gy 19.93±2.871），2），3） 28.92±0.211），2）250μg/ml+2Gy 18.27±2.771），2） 25.39±0.311），2）125μg/ml+6Gy 66.95±4.561），2），3） 24.57±0.141），2）250μg/ml+6Gy 64.83±3.361），2） 22.57±0.301），2）Group 1）compared with control groupP<0.05；2）compared with corresponding dose of 5-FUor RTgroup at the same timeP<0.01；3）compared with same radiological dose of 5-FUor RTgroup at the same timeP<0.05

2.3 熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)

凋亡細(xì)胞對碘化丙錠染料有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。因此，在細(xì)胞凋亡的早期細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光信號（圖2B、2C），而死亡細(xì)胞可被碘化丙錠著染產(chǎn)生紅色熒光（圖2D），正?；罴?xì)胞的熒光很弱僅能看到輪廓（圖2A）。圖2B、2C、2D中均可見到典型的細(xì)胞凋亡改變，細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)凝集，細(xì)胞表面形成突起，部分突起與細(xì)胞脫離，形成凋亡小體。

3 討論

多基因突變的細(xì)胞失控性生長、細(xì)胞增殖失控和凋亡受阻是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要原因［8］。有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的新方法之一，放射可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并加速細(xì)胞凋亡過程而使更多的腫瘤細(xì)胞死亡，從而使腫瘤發(fā)生消退［9］。放療和化療均可誘發(fā)細(xì)胞凋亡［10］。從本研究結(jié)果中可以看出單純5-FU，單純放療及5-FU和放療聯(lián)合都可誘導(dǎo)人子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞凋亡，但聯(lián)合治療的效果明顯高于單純放療或者單純5-FU，說明兩者聯(lián)合后有協(xié)同作用產(chǎn)生，能誘導(dǎo)更多的HeLa 細(xì)胞發(fā)生凋亡，這與文獻(xiàn)報道［6，11］在其他腫瘤細(xì)胞中的作用一致。其單純化療組隨藥物濃度增加凋亡細(xì)胞產(chǎn)生增多且有一定的時間依賴性；單純放療組放療后24h，隨著劑量增加產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞逐漸增多，但放療后48h，隨著劑量的增加凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生反而出現(xiàn)減少，這可能與繼發(fā)性壞死細(xì)胞和細(xì)胞碎片增多有關(guān)。放化療聯(lián)合組中，兩種不同濃度5-FU與放射劑量6Gy的聯(lián)合效果均明顯好于和放射劑量2Gy聯(lián)合的效果；其中5-FU濃度為125μg/ml與放射劑量6Gy的聯(lián)合效果比5-FU濃度為250μg/ml與6Gy放療的聯(lián)合效果還好，誘導(dǎo)產(chǎn)生的早期凋亡細(xì)胞最多。由此可以看出并不是隨著藥物濃度、放射劑量及作用時間的增加就能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的凋亡細(xì)胞，這可能與細(xì)胞在凋亡過程中轉(zhuǎn)化成了死亡細(xì)胞或者是大劑量直接導(dǎo)致了細(xì)胞死亡有關(guān)。提示聯(lián)合應(yīng)用的5-FU劑量過大可能直接導(dǎo)致HeLa細(xì)胞死亡，對正常細(xì)胞也可有嚴(yán)重?fù)p傷，在臨床應(yīng)用過程中5-FU和放療聯(lián)合的效果可能會受5-FU劑量的限制。因此選擇合適劑量的5-FU來與放療聯(lián)合既要獲得良好治療效果又要避免產(chǎn)生較大的副作用非常重要。尋找適當(dāng)?shù)姆派鋭┝亢?-FU藥物濃度進(jìn)行放化療聯(lián)合是進(jìn)一步臨床治療的研究課題。

5-FU結(jié)構(gòu)與尿嘧啶和胸腺嘧啶相似，它通過干擾腫瘤細(xì)胞DNA的合成發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，抗癌譜廣，可用于治療各種腫瘤，已廣泛應(yīng)用于臨床，放療是治療子宮頸癌的重要手段之一，近年來，國內(nèi)外報道認(rèn)為放射與細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)系，細(xì)胞凋亡是放射治療引起細(xì)胞死亡的主要類型之一［4］。細(xì)胞凋亡也稱程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death），是細(xì)胞正常死亡的一種途徑。細(xì)胞凋亡后在形態(tài)學(xué)可以觀察到細(xì)胞固縮，胞質(zhì)濃縮，空泡狀，核致密深染呈多葉狀或新月狀，顆粒常聚集在核周邊，破裂的染色質(zhì)形成圓形或橢圓形大小不等的細(xì)胞凋亡小體（apoptotic bodies），位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或逐漸向細(xì)胞外散落。在本研究中，熒光顯微鏡下觀察到較典型的HeLa細(xì)胞凋亡改變。

CAP是一種新型的5-FU前體藥物，并且是目前口服制劑中唯一療效能超過靜脈給藥的氟尿嘧啶類藥物。CAP口服后經(jīng)小腸吸收入肝臟后，經(jīng)過三步特殊的代謝過程，最后在腫瘤細(xì)胞內(nèi)通過胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylse，TP）轉(zhuǎn)化成 5-FU發(fā)揮抗腫瘤活性，本身無毒性，對腫瘤細(xì)胞選擇性高，特異性強(qiáng)，周身副作用?。?］。本研究前期實(shí)驗(yàn)［13］通過建立裸鼠模型證明CAP對子宮頸腺癌有抑制作用，其與放療聯(lián)合顯示出了比單純CAP化療和單純放療都好的抑制效果。另報道［14］X線放射能提高子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞TP酶的表達(dá)，二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD，5-FU代 謝失活的限速酶）表達(dá)不受影響，TP/DPD比值升高，因而能提高CAP對子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞的抗腫瘤活性。本研究結(jié)果也顯示5-FU和放射聯(lián)合能誘導(dǎo)更多的HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此提示臨床放射治療子宮頸腺癌時，同時投給CAP，可能獲得比5-FU和放療聯(lián)合更佳的治療效果，而且更能減少5-FU的毒副作用，是一種值得期待的子宮頸腺癌聯(lián)合治療方法。

［1］Sherman ME，Wang SS，Carreon J，et al.Mortality trends for cervical squamous and adenocarcinoma in the United States.Relation to incidence and survival［J］.Cancer，2005，103（6）：1258-1264.

［2］朗景和，丁曉曼.當(dāng)前婦科腫瘤臨床診治的特點(diǎn)和問題［J］.癌癥進(jìn)展雜志，2006，1，4（1）：2-6.

［3］Lopez-Graniel C，Reyes M，Chanona G，et al.Type Ⅲ radical hysterectomy after inductionchemotherapy for patients with locally advanced cervical carcinoma［J］.Gynecol Cancer，2001，11（3）：210-217.

［4］Aoki Y，Tomita M，Sato T，et a1.Neoadjuvant chemotherapy for patients younger than 50years with high-risk squamous cell carcinoma of the ce rvix［J］.Gynecol Oncol，2001，83（2）：263-267.

［5］Roberts KB，Urdaneta N，Vera R，et al.Interim results of a randomized trial of mitomycinCas an adjunct to radical radiotherapy in the treatment of locally advanced squamous-cellcarcinoma of the cervix［J］.Int JCancer，2000，90（4）：206-223.

［6］Thomas G，Dembo A，Ackerman I，et al.Arandomized trial of standard versus partially h-yperfractionated radiation with or without concurrent 5-fluorouracil in locally advanced cer-vical cancer［J］.Gynecol Oncol，1998，69（2）：137-145.

［7］Miwa M，Ura M，Nishida M，et al.Design of a novel oral flouropyrimidin carbamate，capecitabine，which generates 5-fluorouracil selectively in tumors by enzymes concentrated in human liver and cancer tissue［J］.Cancer，1998，34（8）：1274-1281.

［8］Waggoner SE.Cervical cancer［J］.Lancet，2003，361（9376）：2217-2225.

［9］潘才住，潘建基，陳傳本.放射誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的研究現(xiàn)狀［J］.中華腫瘤防治雜志，2007，1（14）：61-70.

［10］Balcer-Kubiczek EK，Attarpour M，Jiang J，et al.Cytotoxicity of docetaxel（Taxotere）used as a single agent and in combination with radiation in human gastric，cervical and pancreatic ca-ncer cells［J］.Chemotherapy，2006，52（5）：231-240.

［11］孫寶剛.5－FU在大劑量放療中誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2006，23（2），127-129.

［12］Pervan M，Pajonk F，Sun JR，et al.Molecular pathways that modify tumor radiation respon-se［J］.Am JClin Oncol，2001，24（5）：481-485.

［13］楊濱，閻華，王欣彥，等.卡培他濱與放射聯(lián)合對子宮頸腺癌抗腫瘤效果的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，38（10）︰751-754.

［14］楊濱，閻華，鄒華偉，等.X線照射對HeLa細(xì)胞TP和DPD酶表達(dá)影響及其意義的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2008，15（21）：1639-1642.

（編輯 武玉欣，英文編輯 鄭華川）

Effect of 5-Fluorouracil and Radiotherapy on the Apoptosis of Human Cervical Adenocarcinoma HeLa Cells

YANGBin1，CAIMin1，YANHua2，ZHOUHua-wei1，YANGFan1，LIUYuan1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medicial University，Shenyang 110004，China；2.Department of Gynecology，F(xiàn)amily Planning Research Institute，Affiliated Hospital of Liaoning Province，Shenyang 110031，China）

ObjectiveTo investigate the effect of 5-fluorouracil（5-FU）combined with radiotherapy（RT）on the apoptosis of human cervical cancer HeLa cells.MethodsThe HeLa cells were divided into four groups treated with chemotherapy（ChT），RT，RT+ChT，and control groups.The non-cytotoxic concentration （48h IC50） of HeLa cells treated with 5-FUwas determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）and the apoptosis rates of HeLa cells detected by flow cytometry with annexinⅤ-FITCand PIdouble labeling.The morphologic changes of the apoptosis cells were observed under fluorescence microsope.ResultsChT，RTand RT+ChTtreatment could induce the apoptosis of HeLa cells with the strong induction of the combined treatment （P<0.05）.Conclusion5-FUcombined with RTcan obviously enhance the apoptosis of HeLa cells，which provides a reliable experimental evidence for clinical use of 5-FUcombined with RTin the intervention of human cervical cancer.

5-fluorouracil；radiotherapy；HeLa cells；apoptosis

R711.74

A

0258-4646（2010）01-0024-04

楊濱（1960-），女，教授，博士.E-mail：yangbinfdy@126.com

2009-10-03