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        不同潮氣量機(jī)械通氣對大鼠肺組織HMGB1表達(dá)的影響

        2010-02-01 09:27:46任艷軍張新日
        中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2010年4期
        關(guān)鍵詞:潮氣量肺泡支氣管

        任艷軍,張新日

        (1.山西醫(yī)科大學(xué),太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科,太原 030001)

        機(jī)械通氣具有兩面性,使用不當(dāng)會產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥——呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)。據(jù)最新統(tǒng)計(jì),VILI的發(fā)生率在機(jī)械通氣患者中高達(dá)15%,其發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜,涉及面非常廣泛[1]。本實(shí)驗(yàn)試圖通過測定不同潮氣量機(jī)械通氣大鼠肺組織HMGB1mRNA及其蛋白的表達(dá)水平,探討HMGB1與VILI之間的關(guān)系,從而為VILI的基礎(chǔ)研究和臨床防治提供依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 動物分組及模型制備

        雄性健康W istar大鼠24只(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,合格證號:山醫(yī)字第070101),體重310~380 g,隨機(jī)分為3組:①對照組:未行機(jī)械通氣;②小潮氣量組:VT=7 m L/kg;③大潮氣量組: VT=30 m L/kg。

        25%烏拉坦(4 m L/kg)腹腔注射麻醉大鼠后行氣管切開。除對照組外,其余各組大鼠均通過膠管與動物人工呼吸機(jī)(DH-150型,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠制造)相連接,行機(jī)械通氣。各組大鼠的通氣參數(shù)除潮氣量外,其余均相同,即 I∶E=1∶3,F(xiàn)iO2= 21%,F(xiàn)=60次/min,通氣時(shí)間為150 min。

        通氣結(jié)束后切斷腹主動脈放血處死大鼠,切取肺臟,左肺用中性甲醛液灌注固定,常規(guī)石蠟包埋用于普通病理、免疫組化和原位分子雜交檢測。右肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)(2 m L×4次),留取支氣管肺泡灌洗液(BALF)。BALF回收量不少于80%,以3 000 r/min離心 10 min,取上清液 -30℃凍存待測。

        1.2 大鼠肺組織HE染色

        采用伊紅-蘇木素染色法在光鏡下觀察肺組織和各級支氣管的損傷情況。

        1.3 大鼠 BALF中髓過氧化物酶(M PO)活性測定

        采用髓過氧化物酶檢測試劑盒測定 BALF中MPO活性。測定方法及操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

        1.4 肺組織HMGB1免疫組織化學(xué)染色

        采用鏈霉素親和-生物素-過氧化酶復(fù)合物(SABC)法對肺組織細(xì)支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行HMGB1免疫組織化學(xué)染色,具體操作步驟參照試劑盒說明(試劑盒購自北京博奧森生物有限公司)。兔抗大鼠抗體工作濃度為1∶50,以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷:陽性染色為細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在400倍光鏡下對每張組織切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野或直徑100~200μm的細(xì)支氣管進(jìn)行觀察。采用 BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分別檢測每個(gè)視野HMGB1陽性細(xì)胞的平均光密度值(A),以上述5個(gè)視野的平均值作為該大鼠細(xì)支氣管上皮細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)的相對含量。

        1.5 肺組織HMGB1m RNA原位雜交檢測

        采用原位分子雜交技術(shù)檢測肺組織 HMGB1 mRNA表達(dá),具體操作步驟按試劑盒(購自武漢博士德生物有限公司)說明進(jìn)行。陽性染色為細(xì)胞胞漿呈棕黃色,檢測結(jié)果分析判斷方法同上。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        2 結(jié)果

        2.1 肺組織HE染色

        HE染色光鏡下觀察,對照組肺泡結(jié)構(gòu)和各級支氣管上皮完整,肺間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤。小潮氣量僅見少量炎癥細(xì)胞浸潤,但肺間質(zhì)無明顯水腫。大潮氣量組可見彌漫性肺間質(zhì)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤,肺泡間隔增厚,部分肺泡破裂融合,小血管斷裂,肺泡腔內(nèi)有出血(圖1~2)。

        2.2 大鼠BALF中M PO活性測定結(jié)果

        各組大鼠BALF中MPO活性測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示:與對照組和小潮氣量組比較,大潮氣量組大鼠BALF中MPO活性明顯增高(均P<0.01),對照組與小潮氣量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

        MPO活性用酶活力單位表示,即每克組織蛋白在37℃的反應(yīng)體系中使H2O2分解為1μm為一個(gè)活力單位。

        2.3 肺組織支氣管上皮細(xì)胞HMGB1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

        各組大鼠肺組織支氣管上皮細(xì)胞HMGB1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見表1和圖3~5。結(jié)果顯示,與對照組和小潮氣量組比較,大潮氣量組肺組織支氣管上皮細(xì)胞HMGB1表達(dá)明顯增多(均P<0.01),對照組與小潮氣量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

        表1 各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA,蛋白的表達(dá)及BALF中MPO活性(±s)Tab.1 The expression of HMGB1 mRNA and protein in the lung and MPO in BALF in different groups

        表1 各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA,蛋白的表達(dá)及BALF中MPO活性(±s)Tab.1 The expression of HMGB1 mRNA and protein in the lung and MPO in BALF in different groups

        注:與對照組比較:*P<0.01;與小潮氣量組比較:#P<0.01Note:*P <0.01,compared with the controe group;#P <0.01,compared with the low tidal volume group.

        組別Group 例數(shù)n HMGB1 mRNA表達(dá) HMGB1蛋白表達(dá) BALF中MPO活性(U/L)對照組8 6.94±0.44 6.40±0.47 22.20±5.31小潮氣量組 8 7.27±0.43 6.94±0.57 23.21±6.32大潮氣量組 8 15.70±1.50*# 12.9±0.80*# 51.20±6.01*#

        2.4 肺組織支氣管上皮細(xì)胞HMGB1 m RNA原位雜交檢測

        各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA原位分子雜交測定結(jié)果見表1和圖6~8(圖1~8見彩插3)。結(jié)果顯示,大潮氣量組大鼠肺組織支氣管上皮細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)明顯高于對照組和小潮氣量組(均P<0.01),對照組與小潮氣量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

        3 討論

        大量研究表明,炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子在VILI發(fā)病過程中具有重要作用。肺泡上皮受到機(jī)械牽拉后可釋放多種炎癥細(xì)胞因子,如MIP-1α、TNF-α、LI-1β、LI-6及LI-8等,使中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)大量募集活化。中性粒細(xì)胞和和巨噬細(xì)胞活化后不但產(chǎn)生大量彈力酶和膠原酶,還可釋放大量過氧化物。這些物質(zhì)可直接或間接破壞肺泡上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞,引起肺組織損傷[2]。本研究也證實(shí)了這點(diǎn),病理可見大潮氣量通氣組大鼠肺組織彌漫性肺間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤,肺泡間隔增厚。Brad ley等[3]研究表明,MPO水平與中性粒細(xì)胞數(shù)之間存在極顯著的相關(guān)性,可作為中性粒細(xì)胞的活性標(biāo)志。本研究顯示,大潮氣量組BALF中MPO活性明顯高于小潮氣量和正常組,表明中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)募集,活化在VLIL中起著重要作用,同時(shí)也說明VLIL中確實(shí)存在炎癥反應(yīng)。

        高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種重要的炎癥因子,因其在聚丙酰胺凝膠電泳中具有高遷移率而得名。HMGB1的生物學(xué)活性極為豐富,不但參與細(xì)胞的分化、遷移和再生,還可介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)[4-5]。Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)給予受試小鼠注射純化的重組 HMGB1(10~50μg/只),2 h內(nèi)即出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥癥狀 ,包括嗜睡、腹瀉等。大劑量(500 μg/只)給予,則5只受試鼠中3只分別在 18、30、36 h死亡 ,用帶有缺陷 HMGB1 cDNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中提純出來的蛋白質(zhì)片段給予對照組小鼠,則未出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥,證明觀察到的毒性反應(yīng)是HMGB1所特有的。Abraham等[7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)氣管給小鼠注入HMGB1后發(fā)現(xiàn),肺組織局部中性粒細(xì)胞聚集、間質(zhì)水腫,同時(shí)炎癥細(xì)胞因子如 IL-1β、TNF-α、M IP-2等表達(dá)明顯增多,且呈劑量依賴效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),HMGB1可通過內(nèi)分泌和旁分泌形式作用于單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等,使其表達(dá)一系列炎性介質(zhì)和炎癥因子。這些炎性介質(zhì)和炎癥因子又可進(jìn)一步促進(jìn)HMGB1的釋放,從而形成惡性循環(huán),導(dǎo)致炎癥反應(yīng)逐級放大[6]。

        本研究結(jié)果顯示,大潮氣量組肺組織 HMGB1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平較對照組和小潮氣量組明顯增高(均P<0.01),說明HMGB1在VILI的發(fā)病中可能具有重要作用,但其具體作用機(jī)制目前尚不完全清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道,RAGE(receptor for advanced glycation end products)是目前已知的HMGB1的高親和力受體,它是一種跨膜蛋白,能結(jié)合多種配體。HMGB1與RAGE在細(xì)胞表面結(jié)合,激發(fā)細(xì)胞內(nèi) p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)、NF-κB等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,從而使細(xì)胞釋放其他因子[8]。已有研究證實(shí)大潮氣量機(jī)械通氣可使局部肺組織炎癥細(xì)胞聚集、活化,并釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子,推測大潮氣量機(jī)械通氣可能直接啟動了 HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生HMGB1由于其自身的毒性導(dǎo)致肺損傷,同時(shí)產(chǎn)生的HMGB1參與了其他炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的活化,這些炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子進(jìn)一步導(dǎo)致HMGB1mRNA及其蛋白的高表達(dá),從而生成大量內(nèi)源性 HMGB1導(dǎo)致肺組織的進(jìn)一步損傷。盡管研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在膿毒癥中是一種重要的晚期炎癥因子,但HMGB1可能早期就參與了VILI的發(fā)生。對照組和小潮氣量組上述各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),說明小潮氣量機(jī)械通氣對正常肺組織無明顯影響。

        綜上所述,大潮氣量機(jī)械通氣可使肺組織HMGB1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯增高,從而產(chǎn)生大量的HMGB1參與了VILI的發(fā)生,但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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