張玉潔

(1.文山學(xué)院生化系,云南文山 663000;2.文山州生物資源開發(fā)研究中心,云南文山 663000)

塘房桔是近年來在云南省馬關(guān)縣境內(nèi)選出并大量推廣種植的晚熟鮮食柑桔品種,春節(jié)前 1～2個月成熟。該品種果實扁圓形,平均單果重 20 g,最大果重 49 g。成熟后顏色鮮黃、皮薄緊繃、清香味濃,是當(dāng)?shù)靥赜衅贩N。近十年來,塘坊桔已成為云南省馬關(guān)縣調(diào)整農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)中一個新的經(jīng)濟增長點,至 2007年底塘房桔的種植面積發(fā)展到 8 767畝,總產(chǎn)量達 950噸,總產(chǎn)值達 344萬元。隨著種植規(guī)模的迅速發(fā)展和種植時間的延長,原來的粗放管理改為園藝式的集約化栽培。由于栽培生態(tài)的變化和感病寄主的增加,致使塘房桔病害逐年加重。自 2007～2008年始柑桔炭疽病大規(guī)模流行。該病春季危害幼葉和幼果,夏、秋季節(jié)侵害各階段果實和葉子,導(dǎo)致大面積落葉、落果、形成空枝,產(chǎn)量急劇下降,整個地區(qū)塘房桔產(chǎn)業(yè)受到嚴(yán)重影響,2008年較上年減收約 200萬元,而且有逐年惡化的趨勢,成為生產(chǎn)上亟待解決的難題。2009年下半年,筆者對塘房桔炭疽病進行了系統(tǒng)的研究,報道了病原菌的分離鑒定結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 病原分離

供試分離的塘房桔樣品隨機采自馬關(guān)塘房村的幾個桔園,共選 33個病果,采用馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)進行組織分離培養(yǎng)。具體方法:取桔子典型病斑周圍具有菌絲擴散的組織,依次用 70%乙醇和 0.1%升汞進行表面消毒后置 PDA平板上培養(yǎng),獲得來自病理組織的各種菌株。采用單孢分離法純化分離的菌株,記錄并統(tǒng)計各菌株出現(xiàn)頻率,編號后轉(zhuǎn)管于 PDA培養(yǎng)基,保存在 4℃冰箱內(nèi)待鑒定。

1.2 菌株的促孢和擴繁及孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的觀察鑒定

將純化的菌株分別轉(zhuǎn)接于各種類型促孢培養(yǎng)基上培養(yǎng) 5～7 d后,無菌刮除表層氣生菌絲,然后用滅菌的毛刷蘸無菌水涂刷在底層菌絲表面,置 25～28℃,12 h光照黑暗交替的環(huán)境中培養(yǎng),促使其產(chǎn)生大量孢子供鏡檢鑒定和回接實驗用。菌種鑒定參考真菌鑒定手冊[1-4]。

1.3 回接和病原菌株的確定

利用健康無損的生長期果子,使用傷口接種和噴霧接種兩種方法,各菌株接 3～5個健康柑桔果子。傷口接種方法是先進行桔子表面消毒,用無菌水沖洗后,用接種針在桔子皮上扎一個直徑 0.15 mm的小孔,孔處接種孢子或菌絲片段的懸液后用塑料膜套上,保濕 3 d后去膜,在自然條件下發(fā)病。噴霧接種是將孢子或菌絲片段懸浮液直接噴于健康果子上,其他操作同傷口接種。接種后每 2 d觀察 1次,記載發(fā)病果數(shù)和癥狀,待充分發(fā)病后,取典型病果進行再分離。

2 結(jié)果和分析

2.1 自然發(fā)病桔林的典型癥狀

該病原致病性很強,病害從春季開始顯癥,首先侵害幼葉。幼果長出后侵害幼果,此后可侵害各階段果子和葉子,使葉子、果子大量脫落形成空枝。病害侵害葉子,初為黃色沿葉脈擴散形成不規(guī)則病斑,后使局部甚至大半個葉子枯死 (圖 1);病菌侵害果子,病斑初為黃色或橙色、邊緣不整齊、形狀不規(guī)則的小病斑,后擴大成圓形,黑紅色病斑中間凹陷,大小為 3～10 mm,病斑周圍有黃色暈圈為菌絲擴散 (圖 2)。病害不侵害果肉,但病果、葉子大量脫落。染過病的果子味苦難以食用。

圖1 葉子病斑形態(tài)

圖2 果皮典型病斑形態(tài)

2.2 菌株分離和初步鑒定結(jié)果

通過 33個典型病果的病斑組織分離獲得 45個分離物,依培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征初步歸屬于 5個真菌分類單位 (見表 1)。5個菌株中,分離頻率最高的是細交鏈孢菌 (A lternaria tenuis),分離頻率為97.8%;莖點霉屬 1種 (Phom asp.)分離頻率為91.1%;刺盤孢屬 (Colletotrichumsp.)1株,分離頻率為 88.9%;一種在常規(guī)培養(yǎng)下未能誘導(dǎo)產(chǎn)孢的菌株的分離頻率為 73.3%,曲霉屬 1種 (Aspergillussp.)分離頻率為 26.7%;鐮刀菌屬 1種 (Fusicoccumsp.)分離頻率為 11.1%。

表1 柑桔褐斑病病理組織真菌分離頻率

2.3 病原菌株的確定

回接實驗結(jié)果表明,只有果 1-歌 1株可以誘導(dǎo)健康果子產(chǎn)生典型病斑,而且致病性非常強。傷口接種病原后保濕三天可見周圍邊緣染病褐變,7天后出現(xiàn)明顯的圓形褐斑,其癥狀表現(xiàn)和典型癥狀相似,并可從病斑處分離到此菌,可確定是該病的病原菌。鐮刀菌接種可使果子腐爛,但不表現(xiàn)典型病斑;其它菌株均無明顯病斑產(chǎn)生。噴霧接種發(fā)病遲于傷口接種。

2.4 病原菌的培養(yǎng)性狀、測微和鑒定

果 -歌在 PDA培養(yǎng)基上生長迅速,新生菌絲白色,沿培養(yǎng)基向四周擴展很快;后期菌絲變成灰綠色、鼠灰色,菌絲體茂密 (圖 3)。黑暗培養(yǎng)一周后,刮除氣生菌絲并用毛刷刷無菌水于基內(nèi)菌絲表面,再行光照黑暗交替培養(yǎng)可產(chǎn)生大量分生孢子,全黑暗培養(yǎng)條件下長期培養(yǎng)不產(chǎn)孢。分生孢子器球形,黑褐色或黑色,單質(zhì)或碳質(zhì),散生在培養(yǎng)基表層。分生孢子梗無。分生孢子器近乎球形,有 1孔口,壁革質(zhì)至炭質(zhì),黑色。分生孢子器直徑 83.74～109.22μm,孔口直徑 19.3～34.1μm (圖 4)。分生孢子長圓形,兩端各有油球 1個,孢子大小為5.3～8.2μm ×1.6～2.3μm。根據(jù)以上特征,該病原分類地位為半知菌亞門刺盤孢 (Colletotrichumsp.)真菌[1-4],其種名有待進一步確定。

圖3 接種于 PDA平板培養(yǎng) 3d的菌落形態(tài)

圖4 產(chǎn)孢結(jié)構(gòu) (400×)

3 結(jié)論與討論

分離的菌株進行傷口和噴霧接種發(fā)病癥狀與典型癥狀進行比較,結(jié)果證明,導(dǎo)致此柑桔炭疽病大規(guī)模流行的病原菌為刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)真菌,為強致病性,其種名有待進一步確定。從分離頻率看,極細鏈隔孢菌(Alternaia tenuis)高于Colletotrichumsp.,但經(jīng)過反復(fù)驗證,A.tenuis不導(dǎo)致塘房桔果子發(fā)病。但A.tenuis有如此高的分離頻率,可以認為A.tenuis是塘房桔果內(nèi)一種內(nèi)生菌。很多報道顯示A lternaiasp.為致蘋果、冬棗等黑斑病的病原菌[5-7],而A.tenuis卻不能使塘房桔發(fā)病,或許此桔子品種對A.tenuis有較強的抗病性。

[1] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1979:407,418-420,563,566-571.

[2] 戴芳瀾.中國真菌總匯[M].北京:科學(xué)出版社,1979:819-828.

[3] 中國科學(xué)院微生物研究所《常見與常用真菌》編寫組.常見與常用真菌 [M].北京:科學(xué)出版社,1973:245-247.

[4] EllisMB.Dematiaceous tlgphomycetes[M].Ken England:CM I.1971:464-465.

[5] 吳玉柱,季延平,劉會香,等.冬棗黑斑病病原菌的鑒定[J].中國森林病蟲,2005,(2):1-3.

[6] 趙文華,李一泉.棗樹黑斑病在云南省紅河州發(fā)生的主要癥狀、病原分析、發(fā)生規(guī)律及綜合防治策略[J].石河子大學(xué)學(xué)報,2004,(增刊):152-155.

[7] XU Bing-liang,WEI Zhi-zhen,WANG Xi-lin.Symptoms and identiflcation of black spot disease on apple fruit[J].Plant Protection,2000,(5):6-8.