華海嬰， 馮 欣，2， 趙永星， 葉啟霞

(1.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南鄭州450052;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450051;3.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州450001)

羥基喜樹堿(hydroxycamptothecin，HCPT)是上世紀(jì)六七十年代從我國(guó)特有的珙桐科植物—喜樹中分離提取的微量生物堿，在同類抗腫瘤單體中抗癌作用最強(qiáng)。其對(duì)肝癌、大腸癌、卵巢癌、肺癌等惡性腫瘤顯示了令人鼓舞的治療效果，日益受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界的重視。HCPT目前用于臨床的制劑主要有鈉鹽注射液、鈉鹽粉針及膠囊劑等，但由于其特殊的理化性質(zhì):脂水難溶性、半衰期短、毒副作用大、穩(wěn)定性差、載藥量低等因素，使得目前臨床應(yīng)用受到了限制。本實(shí)驗(yàn)室在建立了一種新的微沉淀-高壓勻質(zhì)法用于羥基喜樹堿納米晶體(HCPT-NCs)制備的基礎(chǔ)上，以肝癌SMMC-7721細(xì)胞為模型，與原制劑比較以評(píng)價(jià)其藥理學(xué)作用。該納米晶體具有分散度高，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，平均晶體大小為355.6 nm，樣品中羥基喜樹堿的平均含量為標(biāo)示量的98.5%。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑 HCPT-NCs(規(guī)格:4 mg)，批號(hào)20080621，鄭州大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制;HCPT-I，批號(hào)20070901，黃石飛云制藥有限公司;DMEM購(gòu)自北京Solarbio科技責(zé)任有限公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;噻唑藍(lán)(MTT)為Amresco產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀測(cè)定相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司;RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司。HCPT-NCs和HCPT-I實(shí)驗(yàn)時(shí)均用培養(yǎng)基稀釋至所需的濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)，人類肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素的DMEM，在37℃，5%CO2，飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，每2～3 d用0.25%胰酶消化傳代，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Forme公司產(chǎn)品;全自動(dòng)酶標(biāo)儀(680型)，美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀(PAS型)，德國(guó)Partec公司產(chǎn)品;PCR擴(kuò)增儀(Tpersonal)，美國(guó)Biometra公司產(chǎn)品;凝膠成像分析掃描儀，美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞(3×104個(gè)/mL)接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為4組，HCPT-NCs組、HCPT-I組、無(wú)藥物干預(yù)組和空白對(duì)照組。藥物組分別加入5種不同濃度的HCPT藥液，終體積每孔100 μL;無(wú)藥物干預(yù)組加入等容積細(xì)胞懸液;空白對(duì)照加入等容積培養(yǎng)液(不含細(xì)胞)。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入 MTT(5 mg/mL)每孔 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，避光振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)值，檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%，通過(guò)Excel計(jì)算IC50值。

1.5 Annexin V/PI雙標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞凋亡 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，于6孔板密度為2 ×107/mL 中，分別加入濃度為20、40、80 μg/mL 的HCPT-I和HCPT-NCs，培養(yǎng)48 h時(shí)分別離心收集HCPT處理SMMC-7721細(xì)胞，用1×PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL單細(xì)胞懸液，用1×Binding Buffer將細(xì)胞調(diào)整至1 ×106/mL 濃度，取100 μL，分別加入5 μL的 Annexin V FITC和5 μL的PI試劑，室溫避光孵育15 min后，加入500 μL 1 ×Binding Buffer，1 h之內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照管和單染管，即未染色細(xì)胞管、單染Annexin V FITC的管和單染PI管。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 離心收集不同濃度處理培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，以TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，參照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，以cDNA的第一鏈為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。用Primer Primier5.0設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，用Bandscan 5.0軟件進(jìn)行半定量分析，以目的基因與β-actin的比值為目的基因的相對(duì)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，計(jì)量資料兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)HCPT對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 不同濃度HCPT處理SMMC-7721細(xì)胞，測(cè)定其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率，結(jié)果顯示HCPT-NCs對(duì)SMMC-7721細(xì)胞有顯著的增殖抑制作用，且隨著HCPT濃度的增加，抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依賴性，見(jiàn)圖1、表1～3。HCPT處理SMMC-7721細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果見(jiàn)表4，由表4中可見(jiàn)，HCPT-NCs的IC50和HCPT-I相比，作用24 h差別不大，作用48 h小了1.15倍，作用72 h小了2.78倍。結(jié)果表明，HCPT-NCs對(duì)SMMC-7721腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于HCPT-I，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，作用越明顯。

圖1 HCPT作用于SMMC-7721細(xì)胞的濃度-抑制率曲線Fig.1 The curve of concentration and restrain percentage of SMMC-7721 under HCPT

表1 HCPT作用24 h對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(±s，n=10)Table 1 The effect of SMMC-7721cell growth under HCPT for 24 hours(±s，n=10)

表1 HCPT作用24 h對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(±s，n=10)Table 1 The effect of SMMC-7721cell growth under HCPT for 24 hours(±s，n=10)

C/(μg/mL)A 值細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%HCPT-NCs HCPT-I HCPT-NCs HCPT-I 0.478±0.018 0.475±0.016 8.67 9.15 10 0.432±0.018 0.435±0.018 14.85 14.28 20 0.373±0.001 0.384±0.005 21.21 19.00 40 0.228±0.014 0.228±0.031 37.60 35.71 5 80 0.141±0.081 0.141±0.011 53.95 51.31

表2 HCPT作用48 h對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(±s，n=10)Table 2 The effect of SMMC-7721 cell growth under HCPT for 48 hours(±s，n=10)

表2 HCPT作用48 h對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(±s，n=10)Table 2 The effect of SMMC-7721 cell growth under HCPT for 48 hours(±s，n=10)

HCPT-NCs與 HCPT-I比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

C/(μg/mL)A 值細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%HCPT-NCs HCPT-I HCPT-NCs HCPT-I 5 0.096±0.011 84.23 78.76 0.628±0.038 0.646±0.015 20.41 18.07 10 0.523±0.011 0.542±0.028 28.79 26.31 20 0.454±0.074* 0.488±0.012 36.08 31.25 40 0.259±0.010** 0.292±0.009 58.17 52.89 80 0.071±0.081**

表3 HCPT作用72 h對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of SMMC-7721 cell growth under HCPT for 72 hours(±s，n=10)

表3 HCPT作用72 h對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of SMMC-7721 cell growth under HCPT for 72 hours(±s，n=10)

HCPT-NCs與 HCPT-I比較，**P ＜0.01。

C/(μg/mL)A 值細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%HCPT-NCs HCPT-I 5 0.563±0.015**HCPT-NCs HCPT-I 0.129±0.012 92.25 84.34 0.892±0.014 47.53 38.13 10 0.549±0.010** 0.66±0.009 59.72 51.52 20 0.298±0.014** 0.442±0.009 70.16 60.20 40 0.064±0.019**

表4 HCPT處理SMMC-7721細(xì)胞不同時(shí)間的半數(shù)抑制濃度Table 4 The IC50of HCPT to SMMC-7721 cell in different time

2.2 流式定量檢測(cè)結(jié)果 不同濃度的HCPT作用SMMC-7721細(xì)胞48 h的凋亡率，見(jiàn)表5。

表5 HCPT處理SMMC-7721細(xì)胞48 h的凋亡率(±s，n=6)Table 5 The apoptosis rate of SMMC-7721 cell under HCPT for 48 hours(±s，n=6)

表5 HCPT處理SMMC-7721細(xì)胞48 h的凋亡率(±s，n=6)Table 5 The apoptosis rate of SMMC-7721 cell under HCPT for 48 hours(±s，n=6)

HCPT-NCs與 HCPT-I比較，*P ＜0.05。

濃度/(μg/mL)凋亡率/%HCPT-NCs HCPT-I 20 21.59±0.91*75.02±1.85 18.12±0.23 40 56.12±1.06* 50.85±2.68 80 86.68±2.17*

2.3 RT-PCR分析SMMC-7721細(xì)胞中survivin mRNA的表達(dá)，見(jiàn)表6和圖2。

表6 HCPT作用SMMC-7721細(xì)胞48 h對(duì)survivin的mRNA表達(dá)的影響(±s，n=6)Table 6 The effect of survivin mRNA of SMMC-7721 cell under HCPT for 48 hours(±s，n=6)

表6 HCPT作用SMMC-7721細(xì)胞48 h對(duì)survivin的mRNA表達(dá)的影響(±s，n=6)Table 6 The effect of survivin mRNA of SMMC-7721 cell under HCPT for 48 hours(±s，n=6)

HCPT-NCs與 HCPT-I比較，*P ＜0.05。

HCPT-NCs HCPT-I無(wú)藥物干預(yù)組組別0.509±0.034 0.896±0.041 0.896±0.041 20 μg/mL 0.752 ±0.036* 0.803 ±0.037 40 μg/mL 0.545 ±0.024* 0.660 ±0.059 80 μg/mL 0.387 ±0.028*

結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度HCPT作用48 h后，隨著藥物作用濃度的增高SMMC-7721細(xì)胞中survivin mRNA表達(dá)與無(wú)藥物干預(yù)組相比逐漸降低;HCPTNCs和 HCPT-I相比，對(duì) SMMC-7721細(xì)胞 survivin mRNA表達(dá)均有顯著性差異(P＜0.05)，相同濃度時(shí)，對(duì)SMMC-7721細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)的影響較大，并且隨著濃度的增大，survivin mRNA表達(dá)逐漸降低。

圖2 不同濃度HCPT作用48 h對(duì)survivin的mRNA表達(dá)的影響Fig.2 The effect of survivin mRNA of SMMC-7721 cell under HCPT with different concentration for 48 hours

3 討論

羥基喜樹堿作為一類極具前景的抗癌藥物，已引起眾多研究者關(guān)注。構(gòu)效關(guān)系研究表明，其內(nèi)酯環(huán)是其活性必須基團(tuán)，但是對(duì)光、pH敏感，往往導(dǎo)致藥理活性降低。針對(duì)該缺陷，眾多學(xué)者紛紛通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾或者改變劑型研制了羥基喜樹堿的前體藥物［1］、微球［2］、乳劑［3］、脂質(zhì)體［4］、聚乳酸納米粒［5］等形式，這些給藥系統(tǒng)能不同程度地穩(wěn)定HCPT的內(nèi)酯環(huán)活性部位，提高溶解性，增加藥物在腫瘤部位的濃度，降低毒副作用，提高療效。

納米晶體是一類由天然高分子物質(zhì)或合成高分子材料制成的粒徑為納米級(jí)的載體，其表面經(jīng)過(guò)生物修飾或理化修飾后具有靶向、緩釋作用［6］。它可以使藥物穩(wěn)定性增加，增加含藥量，血漿中藥物濃度和生物利用度高，延長(zhǎng)半衰期，降低毒性，提高藥物對(duì)組織的親和性等作用?；诩{米晶體粒徑小、表面積大可提高藥物溶出度和生物利用度，與普通溶液劑相比，不但載藥量大，而且安全、無(wú)毒［7］。因此本課題組建立了一種新的制備納米晶體的酸微沉淀-高壓勻質(zhì)法，采用該方法將HCPT制備成載藥量大、穩(wěn)定性好、體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)且具有腫瘤靶向性的納米晶體(已通過(guò)制備工藝、藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布等研究證實(shí)，文章待發(fā)表)。

近年來(lái)研究表明Survivin蛋白與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［8］?，F(xiàn)在已有大量相關(guān)研究表明Survivin與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分裂、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:HCPT-NCs對(duì)肝癌細(xì)胞有明顯的抑制作用，且隨著其濃度的增加，抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴性。其survivin mRNA在肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞中高表達(dá)，隨著HCPT作用濃度的增加，細(xì)胞凋亡增加，其表達(dá)下調(diào)。結(jié)果提示:HCPT可能通過(guò)下調(diào)survivin的表達(dá)誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞的凋亡。

HCPT-NCs和HCPT-I相比，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加，存在逐步提高的顯著性差異，這可能與納米晶體的緩釋作用有關(guān)。

納米晶體作為微粒給藥系統(tǒng)，可以提高藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，有利于細(xì)胞攝取并增加細(xì)胞內(nèi)藥物聚積。有研究報(bào)道，抗腫瘤藥物細(xì)胞內(nèi)藥物濃度直接影響著腫瘤的化療效果，本課題組對(duì)HCPT-NCs細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞內(nèi)藥物聚積量-時(shí)間曲線圖即顯示:在一定時(shí)間內(nèi)，隨HCPT-NCs與細(xì)胞孵育時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)藥物聚積增加，7 h后趨于飽和;在各時(shí)間點(diǎn)，HCPT-NCs組的細(xì)胞攝取藥物量顯著高于HCPT-I組(P＜0.05或0.01)。結(jié)果表明，HCPT-NCs可以顯著提高細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，增加藥物在細(xì)胞內(nèi)的聚積。因此佐證了HCPT-NCs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力和對(duì)基因survivin的抑制作用強(qiáng)于HCPT-I，這也可能和HCPT-NCs的體外溶出度高，藥物基團(tuán)內(nèi)酯環(huán)的穩(wěn)定性提高［9］、載藥量等提高有關(guān)。

本課題組已進(jìn)行了HCPT-NCs在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和荷瘤小鼠組織分布研究工作，結(jié)果證實(shí)HCPTNCs顯著延長(zhǎng)了HCPT的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，提高了血漿中HCPT濃度和在腫瘤組織內(nèi)的分布，HCPT-NCs具有明顯的腫瘤靶向作用。

對(duì)HCPT-NCs有待更深入的研究工作，為新藥研發(fā)提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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