丁林芬， 郭亞?wèn)|， 吳興德， 馬銀海

(1.昆明醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，云南昆明650031;2.昆明學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)系，云南昆明650031)

珍珠菜(Lysimachia clethroides Duby)為報(bào)春花科珍珠菜屬植物，又名扯根菜，紅根草等。全草入藥，具有清熱解毒、活血調(diào)經(jīng)、利水消腫等功效［1］。黃酮類化合物是珍珠菜中的主要化學(xué)成分［2-3］，過(guò)去在含量研究方面主要采用紫外分光光度法測(cè)定黃酮的含量［4-5］，但同時(shí)測(cè)定珍珠菜中槲皮素和山柰酚含量的方法未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定珍珠菜中槲皮素和山柰酚的含量測(cè)定方法，進(jìn)一步完善了珍珠菜的質(zhì)量控制體系。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器 Agilent 1100 series高效液相色譜儀，包括四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，紫外檢測(cè)器，Agilent色譜工作站。

1.2 試劑 乙腈為色譜純(美國(guó)Merk公司)，水為超純水，其它試劑均為分析純。

1.3 材料 槲皮素對(duì)照品(自制，用面積歸一化法測(cè)定其含量＞98%)，山柰酚對(duì)照品(自制，用面積歸一化法測(cè)定其含量＞98%)。珍珠菜樣品采自云南省大理市，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所李錫文教授鑒定為珍珠菜L.clethroides，標(biāo)本現(xiàn)存于該所標(biāo)本室(標(biāo)本號(hào)2006-19)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈-水(含0.4%的磷酸)，梯度洗脫(0～15 min，17∶83～40∶60)，流速:1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm，柱溫:40°C。在上述色譜條件下，對(duì)照品和樣品的色譜見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品和供試品溶液的配制

圖1 珍珠菜的高效液相色譜圖

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品槲皮素5.7 mg，山柰酚5.9 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。分別精密吸取貯備液各1 mL，置于100 mL量瓶中，混勻，制得濃度分別為0.005 7 mg/mL的槲皮素及0.005 9 mg/mL的山柰酚混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取珍珠菜粉末約1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入70%甲醇50 mL，溫度80°C，稱定重量，熱回流3 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，即得供試品溶液。進(jìn)樣前取適量溶液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1，3，5，8，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定其峰面積，以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，槲皮素及山柰酚的回歸方程分別為:

結(jié)果表明槲皮素在0.005 7～0.114 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;山柰酚在0.005 9～0.118 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別為0.85%，0.72%。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于0，2，4，6，8 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別為1.65%，0.88%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測(cè)定槲皮素和山柰酚的含量，結(jié)果槲皮素和山柰酚含量的RSD分別為1.45%，1.79%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5 回收率試驗(yàn)取已知含量的珍珠菜粉末(每克含槲皮素56.5 μg，山柰酚29.2 μg)，共9份，分別加入相當(dāng)于樣品中槲皮素和山柰酚含量的80%，100%，120%的對(duì)照品溶液各3份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以回歸方程計(jì)算3種濃度的平均加樣回收率，槲皮素的平均加樣回收率為97.3%，RSD為1.12%(n=9)，山柰酚的平均加樣回收率為97.2%，RSD為1.94%(n=9)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 樣品含量測(cè)定 取不同批次的珍珠菜粉末1 g，共3批，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄槲皮素和山柰酚的峰面積，由線性方程計(jì)算各自含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 樣品處理方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了提取溶劑，時(shí)間，溫度及料液比等因素對(duì)珍珠菜中槲皮素和山柰酚提取率的影響，并進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:在70%甲醇，1:50料液比，80°C熱回流3 h的條件下，槲皮素和山柰酚的提取率最高。

3.2 流動(dòng)相的選擇 用乙腈-水二元系統(tǒng)進(jìn)行等度洗脫，槲皮素和山柰酚的保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，改用梯度洗脫程序，保留時(shí)間縮短且峰形得到較大的改善。由于槲皮素和山柰酚的結(jié)構(gòu)式中含有羥基，故在流動(dòng)相中加入磷酸，從而使其峰形得到較好的改善。實(shí)驗(yàn)證明，在此條件下能得到較好的結(jié)果。

表1 槲皮素和山柰酚加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)

表2 珍珠菜中槲皮素和山柰酚的含量(μg/g，n=3)

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 經(jīng)紫外掃描，槲皮素和山柰酚在360 nm處有最大吸收，故本試驗(yàn)采用360 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)槲皮素和山柰酚的含量進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。

［1］衛(wèi)生部中華本草編委會(huì)，國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中華本草［M］.第6卷.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:96-98.

［2］鄒海艷，屠鵬飛.珍珠菜黃酮類化合物的研究［J］.中國(guó)天然藥物，2004，2(1):59-61.

［3］任風(fēng)芝，郄建坤，屈會(huì)化，等.珍珠菜脂溶性部位的化學(xué)成分研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，17(4):178-180.

［4］唐麗華，徐向毅，薛振德，等.珍珠菜中黃酮類成分的分離和含量測(cè)定［J］.抗感染藥學(xué)，2005，2(3):118-120.

［5］游本剛，唐麗華，劉揚(yáng).紫外分光光度法測(cè)定珍珠菜中總黃酮含量［J］.中國(guó)野生植物資源，2007，26(1):43-45.