王小梅， 穆長征， 趙田田， 于學(xué)江

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001)

糖尿病心肌病是糖尿病的微血管病變之一，發(fā)病機(jī)制尚不明確。通心絡(luò)膠囊是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制而成的復(fù)方制劑，對內(nèi)皮有保護(hù)作用［1-2］.本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用通心絡(luò)對鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察通心絡(luò)對糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及心臟功能的影響，探討其對糖尿病心肌損傷的保護(hù)作用。

1 方法

1.1 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司，批號:CAS#18883-66-4);通心絡(luò)(河北以嶺醫(yī)藥研究院，批號:070406);MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易公司);JEOL1200EX透射電鏡(日本);美國強(qiáng)生公司SureStep Plus(穩(wěn)步倍加型)血糖測定儀。

1.2 動物分組與模型建立 健康♂性SD大鼠36只，鼠齡7～8 w，體重180～220 g，(由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號:SYXK(遼)2005-0013)，隨機(jī)分為兩組，取24只大鼠以45 mg/kg一次性尾靜脈注射1%STZ溶液，臨用前用0.5 mmol/L的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.5)配制。另12只作為正常對照組 (NC)注入等量上述緩沖液。72 h后尾靜脈取血測定血糖，以血糖濃度大于16.7 mmol/L定為糖尿病模型建立標(biāo)準(zhǔn)。將糖尿病大鼠隨機(jī)分為二組:糖尿病組(DM)、通心絡(luò)干預(yù)組(TXL)。通心絡(luò)干預(yù)組給予通心絡(luò)干粉(主要由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鱉蟲、赤芍、蟬蛻、冰片組成，相當(dāng)于1.43 g生藥/g干粉)0.5 g/(kg·d)溶于水中灌胃，正常對照組和糖尿病組灌胃相同劑量的水，共12周。

1.3 血糖測定 各組大鼠處死前取尾血采用葡萄糖氧化酶-過氧化酶法，應(yīng)用美國強(qiáng)生公司SureStep Plus(穩(wěn)步倍加型)血糖測定儀及血糖測定試紙檢測血糖。

1.4 心臟功能測定 12周末，各組大鼠腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg體重)麻醉，稱量體重后心尖部插管至左室腔內(nèi)，導(dǎo)管另端連接于壓力換能器，即可描記LVP曲線，將LVP電信號輸入Pclab生物信號采集處理系統(tǒng)，分別測量心率、左室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)、左室收縮壓(LVSP)和左室舒張末壓(LVEDP)。取出大鼠心臟，冰鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重。測量心臟體重比(心臟重量指數(shù)，即心臟mg/體重g)。

1.5 電鏡觀察 每組隨機(jī)抽取2只大鼠，用20%烏拉坦腹腔注射麻醉，取左室心肌組織塊，切成1 mm3大小組織塊，超微標(biāo)本入3%戊二醛固定液固定2 h，1%鋨酸固定1 h，逐級酒精、丙酮脫水后，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，切片厚度50 nm，經(jīng)鈾、鉛雙重染色后，JEOL1200EX透射電鏡觀測各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6 毛細(xì)血管基底膜厚度測量 取各組大鼠心肌電鏡毛細(xì)血管照片各10張(100×300倍)，選擇基底膜橫斷區(qū)域 ，每個毛細(xì)血管選擇10個點(diǎn)，分別測量基底膜厚度，取其平均值。

1.7 統(tǒng)計分析 用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 注射STZ后，大鼠逐漸出現(xiàn)多尿、多飲、多食等糖尿病癥狀，體重增長緩慢，伴有不同程度的精神萎靡，皮毛稀疏無光澤，2只大鼠血糖低于16.7 mmol/L棄去，DM組和TXL組在灌胃結(jié)束后各死亡一只，其余20只大鼠均達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 通心絡(luò)對STZ糖尿病大鼠血糖、體重、心臟重量指數(shù)的影響 病程12周時，糖尿病組大鼠血糖明顯高于正常對照組，體重明顯低于對照組，心臟重量指數(shù)明顯升高，通心絡(luò)干預(yù)組與糖尿病組相比，血糖、體重?zé)o明顯差別，心臟重量指數(shù)明顯降低，但仍高于正常對照組。見表1。

表1 3組大鼠血糖、體重、心臟重量指數(shù)比較(±s)

表1 3組大鼠血糖、體重、心臟重量指數(shù)比較(±s)

注:與NC組比較，﹡P＜0.01;與DM組比較，#P＜0.05。

組別 樣本數(shù)/個/(mmol/L) 體重/g 心臟重量指數(shù)/(mg/g)血糖12 9.2±4.56 401.16±43.51 2.95±0.22 DM組 10 29.5±2.21﹡ 318.95±48.02﹡ 4.41±0.62﹡TXL組 10 25.4±3.25﹡ 339.22 ±50.19﹡ 3.36±0.38﹡#NC組

2.3 通心絡(luò)對STZ糖尿病大鼠心臟功能的影響 實(shí)驗(yàn)大鼠心臟功能通過測定左室±dp/dtmax、LVSP、LVEDP來判斷，±dp/dtmax、LVSP、LVEDP改變分別反映心臟收縮、舒張功能異常。12周末 DM組的LVSP、±dp/dtmax明顯低于NC組，LVEDP明顯高于 NC組;而TXL組LVSP、±dp/dtmax明顯高于DM組，LVEDP明顯低于DM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.4 通心絡(luò)對STZ糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響 電鏡下可見NC組大鼠心肌毛細(xì)血管基底膜連續(xù)完整;DM組大鼠心肌毛細(xì)血管基底膜明顯增厚，內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹，呈“駝峰”樣突入管腔;TXL組大鼠心肌毛細(xì)血管基底膜及內(nèi)皮增厚明顯減輕。見表3，圖1。

表2 3組心功能比較(±s) (1 mmHg=0.133 kPa)

表2 3組心功能比較(±s) (1 mmHg=0.133 kPa)

注:與 NC 組比較，﹡ P＜0.01;與 DM 組比較，#P ＜0.05，##P＜0.01。

組別 n LVSP/(mmHg)LVEDP/(mmHg)+dp/dtmax/(mmHg/s)-dp/dtmax/(mmHg/s)1.55±175.35 DM組 10 89.38±5.97﹡ 9.65±0.94﹡ 2 561.37±320.49﹡ 1 989.89±248.76﹡TXL組 10 107.58±6.09﹡## 7.68±0.93﹡## 2 960.58±384.64﹡# 2 483.39±355.35﹡##NC組 12 128.07±7.51 4.91±0.47 3 809.17±142.23 3 41

圖1 3組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的改變

表3 實(shí)驗(yàn)各組毛細(xì)血管基底膜厚度比較(±s)

表3 實(shí)驗(yàn)各組毛細(xì)血管基底膜厚度比較(±s)

注:與NC組比較，﹡P＜0.01;與DM組比較，#P＜0.01。

組別 樣本數(shù)/個 毛細(xì)血管基底膜厚度12 114.91±9.80 DM組 10 247.03±28.00﹡TXL組 10 148.15±21.99﹡#/nm NC組

3 討論

糖尿病心肌病是心臟微血管病變和心肌代謝紊亂引起的心肌廣泛灶性壞死等損害，最終出現(xiàn)心力衰竭、心律失常和猝死，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一［3］，通心絡(luò)是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制而成的中藥復(fù)方制劑，選用人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鱉蟲、赤芍、蟬蛻、冰片等十二味益氣及蟲類通絡(luò)藥，具有益氣活血、通絡(luò)止痛之功效.本實(shí)驗(yàn)采用超微粉碎技術(shù)加工后的通心絡(luò)新劑型，有利于有效成分的溶解和釋放，使療效發(fā)揮更充分。

有研究表明，實(shí)驗(yàn)性STZ糖尿病大鼠心肌細(xì)胞的損傷和糖尿病病人的心臟病變過程基本一致［4］，我們通過建立STZ糖尿病大鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示注射STZ后，大鼠血糖明顯增高，逐漸出現(xiàn)多尿、多飲、多食等糖尿病癥狀。病程12周時DM組大鼠心臟重量指數(shù)明顯升高，說明此時出現(xiàn)心肌肥厚，另外心臟舒張出現(xiàn)異常，該舒張功能異常已被認(rèn)為是左心室功能異常的早期征象之一，同時心臟收縮功能也出現(xiàn)異常改變，表現(xiàn)為LVSP顯著降低，LVEDP顯著升高，±dp/dtmax顯著降低。應(yīng)用通心絡(luò)后，心臟重量指數(shù)明顯降低，TXL組大鼠LVSP顯著升高，LVEDP顯著降低，±dp/dtmax升高，且-dp/dtmax升高比+dp/dtmax升高明顯，表明通心絡(luò)能夠抑制心肌肥厚，改善糖尿病心肌病大鼠心臟舒縮功能障礙，尤其是舒張功能。近期發(fā)現(xiàn)，糖尿病左心室舒張功能減退與糖尿病病程和高血糖有關(guān)，高血糖本身可造成心肌間質(zhì)中膠原沉積增多、使心肌僵硬，順應(yīng)性下降，心臟舒縮功能障礙，Lu L［5］、Yi CC 等［6］的研究中已經(jīng)證實(shí)這一點(diǎn)。另有報道 1 型糖尿病患者心室增加的厚度可通過嚴(yán)格控制血糖，1年后得到部分逆轉(zhuǎn)，提示血糖參與糖尿病心肌病變的發(fā)病機(jī)制［7］，而現(xiàn)代藥理研究表明，人參具滋補(bǔ)、益氣、生津、調(diào)節(jié)免疫等功效，其中所含的人參總皂苷能促進(jìn)葡萄糖的有氧氧化，增加琥珀酸脫氫酶的活性，對胰島素釋放有一定的促進(jìn)作用，水蛭、土鱉蟲、全蝎、赤芍可降低纖維蛋白原，抑制血栓形成，蜈蚣、蟬蛻、冰片能夠散瘀、改善微循環(huán)。應(yīng)用通心絡(luò)干預(yù)后，STZ糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)心臟功能明顯改善，心肌肥厚減輕，說明通心絡(luò)在防治糖尿病心肌病方面具有良好的效果，其機(jī)理可能與上述作用有關(guān)。

心肌微血管病變是糖尿病心肌病的突出表現(xiàn)，微血管基底膜增厚出現(xiàn)較早，當(dāng)基底膜增厚嚴(yán)重時，受累的微血管可部分或全部阻塞，引起組織缺氧，以致病變持續(xù)不斷加重。內(nèi)皮細(xì)胞損傷在微血管病變的發(fā)生中亦起重要作用。反復(fù)的內(nèi)皮細(xì)胞死亡和再生可引起基底膜增厚，使血管口徑縮小，內(nèi)壁粗糙，彈性及收縮力減弱。這些可導(dǎo)致微血管血流不暢、瘀滯，使心肌細(xì)胞缺血，缺氧［8］。本實(shí)驗(yàn)從超微結(jié)構(gòu)觀察中發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌毛細(xì)血管基底膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹，突入管腔，管腔狹窄甚至閉塞，嚴(yán)重影響了心肌的供血，與上述報道一致，其機(jī)制考慮與以下因素有關(guān):① 高血糖情況下，終末糖化產(chǎn)物(AGEs)與細(xì)胞膜上的AGE受體(RAGE)結(jié)合后，激活蛋白激酶(MAPK)、Ras通路(應(yīng)激和細(xì)胞凋亡)以及Jak/Stat通路(基因表達(dá)調(diào)控)等［9］，上調(diào)多種生長因子基因表達(dá)增加［10］;② 高糖促進(jìn)線粒體電子傳遞鏈生成的電力學(xué)梯度產(chǎn)生活性氧(ROS)，增加超氧自由基的生成;③蛋白酶C通路的激活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號通路的改變及血管功能的障礙而促進(jìn)糖尿病微血管病變的發(fā)生和發(fā)展［11］;④血清殘粒脂蛋白代謝過程中產(chǎn)生的FFA(游離脂肪酸)通過多種機(jī)制造成內(nèi)皮的損傷［12］。TXL組大鼠的上述改變有明顯減輕，提示通心絡(luò)可能通過阻斷上述機(jī)制保護(hù)糖尿病心肌病大鼠心臟微血管，減輕微血管病變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通心絡(luò)可明顯減輕糖尿病心肌病變，改善心功能。因此，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對預(yù)防糖尿病心肌病變及延遲其發(fā)生發(fā)展具有一定的作用，值得進(jìn)一步深入研究。

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