吳 霞， 李藥蘭*， 張冬梅， 葉文才

(1.暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東廣州510632;2.暨南大學(xué)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新藥物研究廣東省重點實驗室，廣東廣州510632)

鼻咽癌是我國南方地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤，在廣東、廣西、湖南等地的發(fā)病率尤其高［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，中國廣東省是鼻咽癌的高發(fā)地區(qū)，因此，鼻咽癌素有“廣東癌”之稱。目前鼻咽癌的治療以放療和化療為主，臨床上常用的化療藥如環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶及順鉑等對鼻咽癌有一定療效，但毒副作用大，還存在遠(yuǎn)期效果不明顯和耐藥性等問題［2-3］。因此，開發(fā)新型的治療鼻咽癌藥物是很有必要的。廣東位于我國南方，溫暖潮濕的氣候使廣東的藥用植物資源豐富，民間多年來都有采用草藥及其復(fù)方治療鼻咽部疾病的習(xí)慣。廣州市奇星藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中成藥鼻咽清毒顆粒，具有清熱解毒，化痰散結(jié)的功效，臨床上用于治療熱毒蘊結(jié)的鼻咽腫痛，以及鼻咽部慢性炎癥、鼻咽癌放射治療后分泌物增多等癥。有研究指出，鼻咽清毒顆粒在臨床上可用于鼻咽癌的輔助治療［4］，民間也有將該中成藥用于治療鼻咽癌。本研究擬從用于鼻咽癌輔助治療的中成藥鼻咽清毒顆粒和廣東民間用于治療鼻咽部疾病的中藥中選擇25種中藥，對它們進(jìn)行抗鼻咽癌活性篩選，為尋找具有進(jìn)一步研究價值的抗鼻咽癌中藥打下科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 鼻咽癌細(xì)胞CNE，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。實驗前復(fù)蘇培養(yǎng)，用含10%新生牛血清(杭州四季青公司)和1%雙抗(白云山制藥股份有限公司)的RPMI 1640培養(yǎng)液(GIBCO，美國)培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。取對數(shù)生長期、生長良好的細(xì)胞用于試驗。

1.2 實驗用中藥 實驗用25種中藥(見表1)購自廣州通濟(jì)堂藥店，由廣東省藥材公司高級工程師麥鎮(zhèn)球先生鑒定。25種中藥干燥、粉碎后備用。

1.3 中藥提取物的制備

醇提物的制備:在10 g粉碎的中藥中加入100 mL 95%乙醇，40°C下超聲提取1 h，濾出提取液，重復(fù)3次，合并3次提取液，減壓濃縮、干燥得乙醇提取物。

水提物的制備:在10 g粉碎的中藥中加入100 mL水，加熱回流1 h，濾出提取液，重復(fù)3次，合并3次提取液，減壓濃縮、干燥得各中藥水提物。

揮發(fā)油的制備:提取部分揮發(fā)油含量較高的中藥的揮發(fā)油。在100 g粉碎的中藥中加入500 mL水，用揮發(fā)油提取器提取5 h，用石油醚萃取揮發(fā)油，萃取液中加入無水硫酸鈉干燥，過濾，揮去石油醚，得揮發(fā)油。

將以上3種中藥提取物各稱取2 mg，用DMSO溶解，配制成40 mg/mL的溶液，再分別用培養(yǎng)液稀釋成100 μg/mL的溶液備用。各中藥及其提取物和提取率見表1。

1.4 中藥提取物抗鼻咽癌細(xì)胞活性測定

1.4.1 中藥提取物抗鼻咽癌細(xì)胞活性篩選［5］將MTT溶于磷酸緩沖液(PBS)，配成濃度為5 mg/mL的MTT溶液。將1×104濃度的細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，加入100 μg/mL的藥物，空白對照組加入等量的培養(yǎng)液，每種藥物重復(fù)4孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入30 μL MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去多余的MTT和培養(yǎng)液，加入DMSO(100 μL/孔)溶解。經(jīng)振蕩器振蕩后，酶標(biāo)儀上實驗波長570 nm，參比波長630 nm，測定各孔吸光度OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率IR(%)=(1-試驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。

表1 供試中藥及其提取物和提取率

1.4.2 活性提取物對鼻咽癌細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定［6］腫瘤細(xì)胞懸液(1×104細(xì)胞/mL)接種于平底的96孔板中，37℃條件下、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁。然后孔中的培養(yǎng)液替換成含有不同濃度檢測樣品的生長培養(yǎng)基，每個濃度重復(fù)4孔，空白對照組加入等量的培養(yǎng)液，陽性對照藥為順鉑。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，各孔加入30 μL MTT，4 h培養(yǎng)之后小心地吸出上清液，加入100 μL DMSO，振蕩器振蕩后，在波長570 nm/630 nm下測OD值，計算樣品對細(xì)胞增殖的抑制率，以半數(shù)抑制濃度IC50(50%inhibitory concentration)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 各中藥的水提物、醇提物和部分揮發(fā)油對CNE細(xì)胞的體外增殖抑制結(jié)果 見圖1、2和3(各中藥與表1編號對應(yīng))。

圖1 各藥材水提物對CNE細(xì)胞增殖抑制率/%

從圖1可知，在濃度為100 μg/mL時，所有水提物對鼻咽癌細(xì)胞的增殖抑制作用均不高，其中辛夷水提物(6號樣品)、鴨腳木水提物(22號樣品)和六棱菊水提物(24號樣品)在濃度為100 μg/mL時，對CNE的增殖抑制率分別為24.40%、24.43%和26.48%。

圖2 各中藥醇提物對CNE細(xì)胞增殖抑制率/%

由圖2可知，重樓(10號樣品)和地膽草(16號樣品)的醇提物對CNE細(xì)胞有很好的體外增殖抑制活性，在濃度為100 μg/mL時，兩者對CNE的增殖抑制率分別為83.10%和66.50%，另外，鹵地菊(15號樣品)和兩面針(18號樣品)的醇提物對CNE細(xì)胞的增殖抑制率分別為29.02%和28.88%。

圖3 部分中藥揮發(fā)油對CNE細(xì)胞增殖抑制率/%

由圖3可見，在濃度為100 μg/mL時，所有揮發(fā)油對鼻咽癌細(xì)胞的增殖抑制作用均沒有超過40%，但鴨腳木(22號樣品)和香薷(25號樣品)的揮發(fā)油對CNE細(xì)胞有一定的增殖抑制活性，兩者在濃度為100 μg/mL時對CNE細(xì)胞的增殖抑制率分別為28.02%和30.21%。

2.2 重樓和地膽草醇提物對CNE細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定結(jié)果 如表2所示。

表2 重樓和地膽草醇提物對CNE細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)

進(jìn)一步的測試結(jié)果表明，重樓和地膽草的醇取物對CNE細(xì)胞的 IC50分別為(31.73±0.032)μg/mL和(50.71±0.063)μg/mL(表2)。

重樓是中成藥鼻咽清毒顆粒的組成之一，曾有研究表明，重樓的水提物和醇提物及其中的皂苷對多種腫瘤細(xì)胞有不同程度的抑制作用［7-9］。我們的研究結(jié)果表明，重樓的醇提物對鼻咽癌細(xì)胞有很強(qiáng)的增殖抑制活性。地膽草在華南地區(qū)的資源豐富、民間應(yīng)用廣泛，有文獻(xiàn)記載，地膽草在民間有用于治療鼻咽癌［10］。本研究的結(jié)果一方面為這些中藥的民間應(yīng)用提供了部分的科學(xué)依據(jù)，另一方面，這兩個中藥在治療鼻咽癌的臨床和民間應(yīng)用，增強(qiáng)了我們進(jìn)一步研究它們的抗鼻咽癌活性的信心。目前，對重樓和地膽草的抗鼻咽癌有效成分和作用機(jī)制的研究工作正在進(jìn)行中。

另外，根據(jù)本實驗的篩選結(jié)果，鹵地菊和兩面針醇提物及鴨腳木和香薷的揮發(fā)油對CNE細(xì)胞有一定的體外抑制活性，也有進(jìn)一步研究的價值。

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