高 英， 葉小利， 李學(xué)剛*， 朱小康， 王 亮， 黃文文， 李 平， 馮 平

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400716;2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715;3.北碚區(qū)中醫(yī)院，重慶400700)

糖尿病是以持續(xù)高血糖為基本生化特征的一種綜合病癥。主要是由于體內(nèi)胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足所引起的糖代謝紊亂所致［1］。糖尿病患者長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可產(chǎn)生多種并發(fā)癥［2］。臨床用于治療Ⅱ型糖尿病的藥物主要分為1)胰島素及類似物;2)口服降血糖藥:主要有磺酰脲類、雙胍類、α-葡萄糖抑制劑和胰島素增敏劑等藥物。西藥治療糖尿病療效值得肯定，但各種西藥降糖藥物都有消化道反應(yīng)、肝、腎損害等副作用，且不能有效控制并發(fā)癥。中醫(yī)治療糖尿病療效穩(wěn)定，作用溫和，不良反應(yīng)少，能有效防治并發(fā)癥［3］。因此開發(fā)利用天然植物中藥成為目前糖尿病防治藥物研究中的熱點(diǎn)。

黃精為百合科植物黃精(Polygonatum sibiricum Red.)的干燥塊莖［4］，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有悠久的降血糖應(yīng)用歷史。市面上許多降糖中成藥如降糖通脈片、黃精降糖膠囊等其主要降糖成分均為黃精。黃精多糖是其主要活性成分，具有降血糖［5］、抗衰老作用［6］、增強(qiáng)免疫功能［7］等多種功效。

針對(duì)黃精的降血糖活性研究，已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，但大多采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證從其提取的活性成分的功效，對(duì)于以α-葡萄糖苷酶為靶標(biāo)，在黃精中篩選降血糖活性成分卻較少。因此我們采用α-葡萄糖苷酶對(duì)黃精多數(shù)活性物質(zhì)中具有降血糖活性的成分進(jìn)行篩選，在黃精中篩選出高抑制活性的成分之后，對(duì)高抑制活性的成分進(jìn)行提取、分離、純化和成分鑒定，及對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，并研究了各組分對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用。

1 材料

1.1 藥材 試驗(yàn)材料黃精購(gòu)自重慶北碚藥材市場(chǎng)，由西南大學(xué)藥學(xué)院李學(xué)剛教授研究鑒定。

1.2 試劑 4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，Sigma公司;谷胱甘肽，Sigma公司;所用標(biāo)準(zhǔn)單糖:D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖，均為Sigma產(chǎn)品;蒸餾水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

1.3 儀器 RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);Hitachi U-1800型紫外分光光度計(jì)(日本Hitachi儀器公司);CS1013電熱鼓風(fēng)干燥箱(中國(guó)重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);FD-ID冷凍干燥箱(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);Perkin Elmer one紅外分析儀(Perkin-Elmer公司);DEAE纖維素柱(上海亞榮生化儀器廠);GC-2010氣相色譜儀(日本島津公司)。

1.4 動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，體重18～22 g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物室提供。

2 方法

2.1 多糖的提取 500 g黃精置于70℃烘箱烘干，粉碎，5倍工業(yè)乙醇提取3次，減壓濃縮至干，得到浸膏153.7 g。雙蒸水1:5溶解浸膏，超聲溶解。對(duì)多糖提取液需進(jìn)行脫色處理，即以1%的比例加入活性炭。然后以α-葡萄糖苷酶為靶標(biāo)測(cè)定活性組分位于有色部分或者是脫色后提取液部分。

2.2 多糖的分離純化 確定研究對(duì)象后，用Sevage法去除樣品中的蛋白質(zhì)，即用氯仿:戊醇或丁醇，4:1比例混合，加到樣品中振搖，使樣品中的蛋白質(zhì)變性成不溶狀態(tài)，離心除去;通過逆向流水透析除去低聚糖等小分子雜質(zhì)。

2.3 多糖的鑒定

2.3.1 溶解性:稱取純化后的多糖0.5 g，加入3 mL的水，常溫下攪拌，觀察其溶解性。

2.3.2 Molisch反應(yīng)(α-萘酚反應(yīng)):取檢品的水溶液1 mL，加5%萘酚試液數(shù)滴振搖后，沿管壁滴入5～6滴濃硫酸，使成兩液層，待2～3 min后，觀察兩層液面出現(xiàn)環(huán)的顏色。

2.3.3 淀粉的碘反應(yīng):將純化后的得到的多糖配制成5%的溶液，滴加碘液0.2 mL，水浴加熱，觀察顏色是否有變化，同時(shí)做淀粉的對(duì)比試驗(yàn)。

2.3.4 紅外圖譜分析:將多糖與溴化鉀烘干后，稱取多糖2 mg與100 mg的溴化鉀研磨，壓片，置于紅外圖譜分析儀中作紅外分析。

2.4 4個(gè)不同分子量級(jí)透析袋將活性組分分成4段，α-葡萄糖苷酶測(cè)定各組分活性，苯酚-硫酸法測(cè)定4個(gè)分子量級(jí)多糖含量［8］。

2.5 黃精多糖中單糖的組成分析

在趙國(guó)華［9］法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn):實(shí)驗(yàn)前取一平底玻璃燒瓶，塞上膠塞，膠塞上插入兩根小細(xì)管，一根進(jìn)氣，一根排氣。分別取各分子量級(jí)的黃精多糖10 mg置于其中，加入2 mL 2 mol/L三氟醋酸(CF3COOH)，塞上塞子通N2。待反應(yīng)體系的空氣已被N2交換完畢，即拔出管子，密封反應(yīng)體系。置于油浴120℃水解2 h，冷至室溫，用玻璃棉濾去殘?jiān)?，用少量水洗殘?jiān)?次，合并濾液，減壓蒸干，再加少量水3次，減壓蒸干以除去殘存的CF3COOH。水解物在真空干燥箱中70℃減壓干燥過夜。分別加入約10 mg鹽酸羥胺及1 mL無水吡啶，溫?zé)崛芙夂笤?0℃反應(yīng)30 min，冷至室溫，加入1 mL無水醋酸酐，在90℃下繼續(xù)反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，加入1 mL H2O攪拌，再用氯仿萃取3次，每次1 mL，合并氯仿層，減壓抽干。置真空干燥箱減壓干燥24 h。同法制備各種標(biāo)準(zhǔn)單糖的糖腈乙酸酯衍生物，分別進(jìn)行氣相色譜分析。

無水吡啶的制備:吡啶用KOH干燥，經(jīng)分餾柱進(jìn)行蒸餾，收集114℃ ～116℃餾分。

無水醋酸酐的制備:醋酸酐經(jīng)無水硫酸鈉干燥，蒸餾收集139℃組分。

色譜條件:OV-225石英毛細(xì)管柱;FID檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫100℃程序升溫，100℃(1 min)6℃/min至180℃(1 min)，3℃/min至240℃(1 min)，載氣為高純氦，分流比10∶1。

2.6 α-葡萄糖苷酶法測(cè)定抑制活力 在Pierre［10］法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn):取pH 6.8磷酸鹽緩沖液2010 μL，適待測(cè)樣品溶液250 μL，3 mmol/L 的谷胱甘肽80 μL 和實(shí)驗(yàn)室自制 α-葡萄糖苷酶 80 μL，混勻，37℃恒溫水浴保溫10 min，再向反應(yīng)體系中加入80 μL 4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，立即于400 nm處測(cè)定在酶的作用下釋放出對(duì)硝基苯酚pNP的量，不加待測(cè)品溶液作為空白對(duì)照(pH 6.8磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足)，每2 min讀取一次吸光度值A(chǔ)并記錄，記錄30組值。每個(gè)樣品同時(shí)做3個(gè)平行，取平均值，然后做吸光度A隨時(shí)間t變化的關(guān)系曲線，可以發(fā)現(xiàn)吸光度A與時(shí)間t成正比例關(guān)系。取斜率K值，計(jì)算各組分抑制率。

抑制率 =(K空白-K樣品組)/K空白

2.7 對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用 取180只健康小鼠，♀♂各半，平衡飼養(yǎng)3 d。采用尾部靜脈注射四氧嘧啶，注射劑量70 mg/kg。3 d后測(cè)定空腹血糖。血糖值15.0～24.0的小鼠為成功造模小鼠，總計(jì)140只。將140只小鼠隨機(jī)分成7組，每組20只，分別為空白組，阿卡波糖組，黃精浸膏組，4組不同分子量的黃精多糖組，按表5中劑量給藥，1次/d，分別給藥后第6天，第9天采用尾靜脈取血，血糖儀測(cè)定空腹血糖值［11］。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃精多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶影響研究結(jié)果 脫色后，α-葡萄糖苷酶法測(cè)定，結(jié)果顯示脫色后的提取液的抑制率為84%，而有色部分抑制率為38%，活性絕大部分位于脫色后的提取液中。

3.2 多糖的鑒定

3.2.1 溶解性:通過攪拌，純化后的黃精多糖溶解性好，溶解后無雜質(zhì)。

3.2.2 Molisch反應(yīng)(α-萘酚反應(yīng)):通過觀察，可看到兩層液面出現(xiàn)紫紅色環(huán)。

3.2.3 淀粉的碘反應(yīng):結(jié)果顯示，多糖溶液沒有變藍(lán)的現(xiàn)象出現(xiàn)，說明溶液中不含淀粉，提取液中成分不是淀粉。

3.2.4 紅外圖譜分析:將純化后的多糖進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果如圖1。

圖1 黃精多糖紅外吸收光譜Fig.1 Infrared absorption spectrum of polysaccharide

從紅外光譜圖可知，所提黃精多糖具有典型的多糖吸收峰，其特征吸收峰及所對(duì)應(yīng)的功能團(tuán)見表1［12］。

表1 黃精多糖紅外吸收光譜數(shù)據(jù)Table 1 Data of infrared absorption spectrum for polysaccharide

3.2.5 α-葡萄糖苷酶測(cè)定4個(gè)分子量級(jí)黃精多糖組分活性高低，結(jié)果如表2。

3.2.6 各分子量級(jí)黃精多糖含量測(cè)定:苯酚-硫酸法測(cè)定各各分子量級(jí)別黃精多糖的含量，結(jié)果如表3。

表2 4個(gè)分子量級(jí)多糖組分活性Table 2 Inhibit activity of four molecular-level polysaccharide

表3 4個(gè)分子量級(jí)多糖組分含量Table 3 Content of four molecular-level polysaccharide

3.2.7 黃精多糖的組成分析:氣相色譜分析酸水解后各分子量級(jí)黃精多糖，結(jié)果如表4。

表4 4個(gè)分子量級(jí)多糖的單糖組成及含量Table 4 Monosaccharide composition and content of four molecular-level polysaccharide

3.3 黃精浸膏及各級(jí)分子量黃精多糖的降血糖作用

從表5的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，黃精多糖組(2 000＜M＜14 000)具有較好的降血糖功效。

表5 黃精浸膏及4個(gè)分子量級(jí)黃精多糖對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖的影響Table 5 Effect of extract from Polygonatum sibiricum and four molecular-level polysaccharide on blood sugar of diabetic mice induced by streptozotocin

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以α-葡萄糖苷酶為靶標(biāo)，對(duì)黃精的降糖活性成份進(jìn)行篩選。將篩選出來的降糖活性成分-黃精多糖，提取純化后以分子量為基礎(chǔ)進(jìn)行分段，這樣把分子量、多糖組成、單糖比例三者聯(lián)系在一起，對(duì)傳統(tǒng)的黃精多糖分析方法-提取、純化、水解后分析單糖組成、構(gòu)效關(guān)系，做出補(bǔ)充。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:黃精多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有很強(qiáng)的抑制作用。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，單一葡萄糖形成的多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性最強(qiáng)，降糖活性也最強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)采用酸水解、乙?；蜌庀嗌V法進(jìn)行單糖組成分析。實(shí)驗(yàn)前自制反應(yīng)環(huán)境-實(shí)驗(yàn)前取一平底玻璃燒瓶，塞上膠塞，膠塞上插入兩根小細(xì)管，一根進(jìn)氣，一根排氣。較之于趙國(guó)華［9］法水解時(shí)封管實(shí)驗(yàn)，這樣操作起來更加簡(jiǎn)便。

傳統(tǒng)的針對(duì)黃精的降血糖活性研究，大都采用提取出活性成分之后再做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其藥理功效的方法，這樣費(fèi)時(shí)費(fèi)力。我們課題組實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新之處是用α-葡萄糖苷酶對(duì)黃精中多數(shù)活性物質(zhì)中具有降血糖活性的成分進(jìn)行篩選。這樣可以就活性成分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用做出比較，且在實(shí)驗(yàn)的后續(xù)工作中，更能有針對(duì)的提取活性成分，比傳統(tǒng)方法更經(jīng)濟(jì)，更具可行性。

傳統(tǒng)的α-葡萄糖苷酶法如 Pierre［10］等的方法，以pNPG為底物，Na2CO3溶液作為終止液，測(cè)定α-葡萄糖苷酶活性。抑制率計(jì)算公式為:抑制率 =(A空白-A樣品組)/A空白。而本研究在酶、抑制劑37 ℃水浴保溫10 min后加入pNPG，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)定在酶的作用下釋放出硝基酚的量，每2 min測(cè)定一次吸光度A，以A隨時(shí)間t變化的斜率K值作為計(jì)算抑制率的依據(jù)。此種測(cè)定方法是以檢測(cè)時(shí)間內(nèi)的平均值作為計(jì)算的依據(jù)，這樣可以減少實(shí)驗(yàn)環(huán)境、人為因素的影響，比傳統(tǒng)的方法更準(zhǔn)確，同時(shí)也容易觀察各抑制劑的抑制效果隨時(shí)間變化的關(guān)系。

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