楊 旻， 陳科力

(湖北中醫(yī)學院，省部共建中藥資源和中藥復方教育部重點實驗室，湖北武漢430065)

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖，有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結的功效。半夏為我國傳統(tǒng)大宗藥材，近年由于需求增加，野生資源日漸減少，栽培半夏成了主流商品。種質(zhì)資源是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的一個重要因素，已有文獻對半夏種質(zhì)資源進行了研究，但尚未對不同類型半夏種質(zhì)資源建立分子標記鑒定方法［1-3］。

ISSR(簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性，Inter Simple Sequence Repeat)分子標記技術以其簡便迅速、多態(tài)性高、重復性好等優(yōu)點被廣泛應用于動植物的品種鑒定、DNA指紋圖譜構建和生物多樣性研究等領域，在中草藥種內(nèi)和種間鑒定等方面也得到廣泛運用［4-6］。本實驗采用ISSR方法對不同產(chǎn)地、不同表型的半夏共35份樣品進行研究，構建其DNA指紋圖譜，在分子水平上探討其產(chǎn)地與種質(zhì)資源遺傳差異的相關性。

1 材料與儀器

1.1 材料 35份半夏樣品按葉片數(shù)量和形態(tài)進行分類［1］，具體見表1。其中來自河南三門峽、四川南充、江西廬山、湖北荊門、十堰、大悟、襄樊的半夏樣品均為野生品種，余為栽培品種。采樣時采摘半夏的嫩葉，每份樣品由5～10個半夏個體組成，置于盛有硅膠的塑膠袋中干燥保存。

表1 不同表型半夏及其產(chǎn)地Tab.1 Phenotypes and habitats of Pinellia ternata

1.2 試劑與儀器 用于ISSR反應的Taq酶、Mg2+、dNTPs、標準分子量(Marker)100 bp Ladder購自北京Tiangen公司;引物、Sybral Green I購自上海Sangon公司。PCR反應在美國BIO-RAD公司的PTC-0200型PCR儀上進行，擴增結果由北京六一WD-9413A型凝膠成像分析系統(tǒng)檢測。

2 實驗方法

2.1 總DNA提取與濃度測定 采用北京Tiangen公司植物總DNA提取試劑盒提取基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)樣品OD260/OD280分析純度，以1.8左右為宜，根據(jù)OD260值計算樣品DNA濃度。

2.2 ISSR擴增及產(chǎn)物檢測 ISSR引物序列參考Univer sity of British Columbia提供的標準序列，通過預實驗從80個引物中篩選出8個能穩(wěn)定擴增且背景清晰的引物(表2)。ISSR-PCR的最佳反應體系為20 μL反應體系中含有Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 250 μmol/L、引物0.5 μmol/L、Taq DNA 聚合酶1U、20 ng模板DNA、2%甲酰胺。PCR擴增程序為:95℃預變性3 min;94℃變性30 s，Tm℃復性45 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán);72℃延伸5 min。

表2 ISSR擴增引物序列及退火溫度Tab.2 Names of ISSR primers，sequence and annealing temperature

擴增反應結束后，PCR產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TAE，電壓5 V/cm，電泳結束后在凝膠圖像分析儀上觀測分析并照相。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 根據(jù)ISSR擴增條帶的有無，分別以1和0表示。在相同遷移位置，有條帶記為1，無條帶記為0。用SPSS15.0計算樣品間的Jaccard相似系數(shù)，并進行聚類分析，建立樣品間的親緣關系樹。

3 結果與分析

對表1中35個不同產(chǎn)地及表型的半夏進行ISSR擴增，結果見表3和圖1。Jaccard相似系數(shù)矩陣和聚類系統(tǒng)樹見圖2。共擴增出104條帶，其中97條具有多態(tài)性，多態(tài)位點百分率為93.3%。各引物擴增的條帶數(shù)為8～20條，平均擴增條帶數(shù)為13.0條。

表3 不同產(chǎn)地及不同表型半夏ISSR擴增結果Tab.3 The ISSR amplified results of Pinellia ternate with different phenotypes and from different habitats

圖1 引物UBC843 ISSR擴增譜帶M.100 bp DNA Ladder1～35代表的物種順序見表1Fig.1 ISSR bands amplified with primer UBC843M.100 bp DNA Ladder，the number of 1 ～35 refers to the spieces listed in Tab.1

圖2 不同產(chǎn)地及不同表型半夏聚類圖Fig.2 Dendrogram of Pinellia ternate with different phenotypes and from different habitats

從Jaccard相似系數(shù)矩陣中可知各產(chǎn)地半夏間的相似系數(shù)在0.389～0.922之間。聚類圖上顯示產(chǎn)地先于表型聚類在一起，如圖2大致分為4支，A支主要由湖北襄樊樊城區(qū)各表型半夏構成，B支由山西運城、四川南充、河南三門峽、陜西商洛和湖北十堰半夏構成，C支由山東高密和湖北襄樊襄陽構成，D支由湖北大悟、荊門和山東臨沂構成。35個樣品中貴陽三葉細葉、三葉闊葉、臨沂三葉闊葉、高密三葉細葉、五葉細葉等5個栽培樣品未按地區(qū)聚類，說明栽培樣品的原始種群可能來自于不同地區(qū)。若將各野生半夏進行聚類，則能清晰看出它們按產(chǎn)地分為5支，且各地間的遺傳距離較遠，如圖3，①為湖北襄樊樊城區(qū)，②為湖北襄樊襄陽區(qū)和江西廬山，③為湖北十堰和四川南充，④為河南三門峽和湖北荊門，⑤為湖北大悟。

圖3 不同產(chǎn)地及不同表型野生半夏聚類圖Fig.3 Dendrogram of Pinellia ternate in the wild with different phenotypes and from different habitats

4 討論

4.1 眾多文獻中依據(jù)葉型將半夏分為不同類型。我們的ISSR研究結果顯示35個不同表型和產(chǎn)地的半夏居群樣品按產(chǎn)地各自聚為一類，表明地理因素對半夏種質(zhì)遺傳多樣性的影響較葉形態(tài)特征的表型差異更加重要。綜合分析半夏各居群的Jaccard相似系數(shù)，可知不同葉型半夏種群間的相似性高，而不同地區(qū)間的相似性較低，提示半夏尤其是野生半夏的種質(zhì)資源群類應以地區(qū)劃分為主，表型為輔。相對于野生半夏，栽培半夏聚類較混亂，可能與栽培樣品的種質(zhì)來源較多有關。例如據(jù)我們的調(diào)查，山東高密和臨沂的半夏種莖，就來自于湖北和河南兩地。

4.2 產(chǎn)地生態(tài)和地理環(huán)境是影響藥材質(zhì)量的一個重要因素，但藥材的產(chǎn)地屬性通常很難確認。本試驗ISSR譜明確顯示絕大部分野生半夏依據(jù)不同地區(qū)各自聚類，揭示了產(chǎn)地與種質(zhì)資源類群的聯(lián)系。因此，我們可以建立各個地道產(chǎn)地野生半夏的各個序列的ISSR譜系，作為鑒別不同產(chǎn)地野生半夏種質(zhì)資源的輔助方法。

4.3 ISSR標記結合了SSR標記技術和RAPD標記技術的特點，但比SSR標記更簡便，比RAPD標記更穩(wěn)定，多態(tài)性更高。由于采用了較高的退火溫度，因此ISSR分子標記具有更高的可重復性。本研究擴增得到的半夏ISSR帶型表現(xiàn)出很高的多態(tài)性，而且可重復性較好，說明該ISSR分子標記是評估半夏遺傳多樣性的有效方法。通過該研究發(fā)現(xiàn)半夏種內(nèi)不同產(chǎn)地和表型之間具有較高的遺傳多樣性，其中產(chǎn)地差異是造成種質(zhì)資源多樣性的主要原因，要有效保護半夏的遺傳資源，需要保護盡可能多的居群，尤其是野生居群。

［1］魏淑紅，彭正松.半夏群體性狀變異類型研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2004，(4):37-39.

［2］馬小軍，李西文，杜 鵑，等.加權打分法定量評價半夏種質(zhì)資源的研究［J］.中國中藥雜志，2006，31(12):975-977.

［3］杜 娟，馬小軍，李學東.半夏不同種質(zhì)資源AFLP指紋系譜分析及其應用［J］.中國中藥雜志，2006，31(1):30-33.

［4］周延清，景建洲，李振勇，等.淮區(qū)地黃遺傳多樣性的ISSR鑒定［J］.中草藥，2005，36(2):257-261.

［5］王曉慧，湯曉闖，楊恩秀，等.莪術不同種和居群的ISSR-PCR分析［J］.中國中藥雜志，2008，33(18):2037-2040.

［6］吳志剛，冷春鴻，陶正明，等.參薯種質(zhì)遺傳多樣性的ISSR分析［J］. 中國中藥雜志，2009，34(23):3017-3020.