郭延生， 華永麗， 鄧紅娟， 魏彥明

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070)

當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diles具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)燥滑腸等作用［1］，現(xiàn)代藥理研究證明當(dāng)歸具有降血壓、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗輻射，以及抗損傷、增強(qiáng)免疫功能、抗氧化和清除自由基作用［2］。其臨床常用的炮制品有酒當(dāng)歸、土當(dāng)歸、當(dāng)歸炭和油當(dāng)歸等［3］，我們的前期研究表明，當(dāng)歸體外能清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化，并且炮制品不同，清除自由基作用也有所差異［4～6］，這可能是由于當(dāng)歸經(jīng)過(guò)不同方法炮制后，化學(xué)成分發(fā)生不同程度的變化所引起。因此，研究當(dāng)歸不同炮制品清除自由基作用與活性成分之間的關(guān)系，對(duì)闡明當(dāng)歸不同炮制品清除自由基的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和當(dāng)歸炮制機(jī)理至關(guān)重要。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)各位專家對(duì)中藥譜效關(guān)系的研究提出了各自的主張，如羅國(guó)安將多維多信息特征圖譜應(yīng)用于中藥分析鑒定中，建立了中藥注射劑多維多信息特征指紋圖譜，可系統(tǒng)完整地解決藥效和質(zhì)量相關(guān)的問(wèn)題。并且提倡開(kāi)展指紋圖譜信息與藥效活性信息的相關(guān)性研究，從而實(shí)現(xiàn)中藥化學(xué)指紋圖譜向中藥藥效指紋圖譜的轉(zhuǎn)化［7］。梁逸曾利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，將中藥指紋圖譜中化學(xué)成分的變化和中藥藥效結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)，建立了有實(shí)際意義的“譜效學(xué)”，為中藥的質(zhì)量控制和藥效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供了規(guī)律性的科學(xué)依據(jù)［8］。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)計(jì)量學(xué)中多元線性回歸分析方法研究了當(dāng)歸不同炮制品醇提液清除自由基與化學(xué)指紋峰之間的關(guān)系，闡明了當(dāng)歸炮制品清除自由基的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物和試劑

當(dāng)歸購(gòu)于甘肅岷縣藥材市場(chǎng)，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)學(xué)教研室魏彥明教授鑒定。阿魏酸(批號(hào)0773-9910)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

甲醇、乙腈為色譜純;乙酸、無(wú)水乙醇、石油醚、FeSO4·7H2O、水楊酸、H2O2、鄰苯三酚、鹽酸等，均為國(guó)產(chǎn)分析純;三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)為進(jìn)口上海分裝。

1.2 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó))、OPPON-3000型紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(韓國(guó))、AL104電子分析天平(德國(guó))、CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀(上海新拓)、RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)、TBZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(湘儀)、HH-501超級(jí)恒溫水浴箱、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵、C型玻璃儀器氣流烘干器、XW-80型旋渦混合器等。

2 方法

2.1 當(dāng)歸飲片的炮制［9-10］酒當(dāng)歸:取當(dāng)歸飲片，加適量黃酒拌勻，稍悶，待酒被吸盡后，用文火炒至深黃色，微具酒香氣時(shí)，取出放涼。土當(dāng)歸:將適量土粉置鍋內(nèi)炒熱，倒入當(dāng)歸飲片，微炒至當(dāng)歸片粘滿細(xì)土?xí)r取出，篩去土粉，放涼即可。當(dāng)歸炭:取當(dāng)歸飲片，置鍋內(nèi)，用中火炒至當(dāng)歸外表焦黑色，內(nèi)部棕褐色，略具焦氣，質(zhì)枯脆時(shí)，取出放涼。油當(dāng)歸:取當(dāng)歸飲片，加入適量香油拌勻，悶潤(rùn)，文火炒至色澤加深，微顯焦斑，待顯油潤(rùn)有香氣時(shí)出鍋，晾涼。

2.2 當(dāng)歸及其炮制品醇提液的制備 取當(dāng)歸及其炮制品各100 g，加80%乙醇60℃進(jìn)行超聲提取2次，每次30 min。合并兩次提取液，回收乙醇，濃縮成1 g/mL浸膏，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 對(duì)羥自由基(·OH)清除率的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)采用Fenton法［4-6］，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，向反應(yīng)體系中加入20、40、80、160 mg/mL 當(dāng)歸不同炮制品，搖勻后在37℃ 水中溫育2 h，測(cè)510 nm處的吸光度，平行測(cè)定5次，計(jì)算清除率，根據(jù)量效曲線計(jì)算IC50值。

2.5 當(dāng)歸炮制品的HPLC測(cè)定［11-12］

2.5.1 供試品溶液制備 精密稱取當(dāng)歸炮制品粉末(40目)0.5 g，置50 mL具塞三角瓶中，精密量取甲醇-甲酸(95∶5)溶液25 mL加入三角瓶中，密封，稱重，超聲提取60 min，放置至室溫，稱重，補(bǔ)足失重，0.45 μm濾膜過(guò)濾。取續(xù)濾液進(jìn)樣10 μL。

2.5.2 阿魏酸對(duì)照品溶液制備 稱取阿魏酸對(duì)照品4.8 mg，加甲醇至100 mL量瓶中，得4.8 μg/mL對(duì)照品溶液。

2.5.3 色譜條件 ODS-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)分析柱;流動(dòng)相:1%乙酸水(A相):乙腈(B相);梯度洗脫條件:B，0～10 min(20% ～30%);10～20 min(30～49%);20～40 min(49%);40～50 min(49% ～100%);50～60 min(100% ～20%)。流速:1 mL/min;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。

2.5.4 指紋峰的鑒定 采用相對(duì)保留時(shí)間確認(rèn)指紋峰，以阿魏酸對(duì)照品作為參照物，相對(duì)保留時(shí)間即各指紋峰保留時(shí)間與同一圖譜中阿魏酸峰的保留時(shí)間比值。

2.5.5 精密度 取同一份當(dāng)歸炮制品樣品作為供試液，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算得各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間 RSD為0.1% ～0.24%，峰面積 RSD為0.66% ～1.66%，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。

2.5.6 穩(wěn)定性 取同一份當(dāng)歸炮制品樣品作為供試液，分別于0、3、6、9、12、15 h 檢測(cè)，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.08% ～0.35%，峰面積RSD為0.39% ～2.56%，表明供試液在15 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性 取當(dāng)歸炮制品樣品6份，分別精密稱定，按供試品溶液制備方法平行制備供試液，再分別按上述液相色譜條件測(cè)定，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.28% ～0.46%，峰面積RSD為0.75% ～1.82%，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。

2.6 譜效關(guān)系的建立 采用SPSS 13.0將不同炮制品對(duì)自由基的半數(shù)清除率(IC50)與不同炮制品各指紋峰的峰面積之間進(jìn)行多元線性回歸分析。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸炮制品醇提液對(duì)羥自由基的清除作用

由表1可知，當(dāng)歸及其炮制品醇提液對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH均有一定的清除作用，抑制率隨濃度的增大顯著升高(P＜0.01)，呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系。不同炮制品半數(shù)抑制率(IC50)從小到大依次為當(dāng)歸炭、酒當(dāng)歸、土當(dāng)歸、生當(dāng)歸和油當(dāng)歸，見(jiàn)圖1。說(shuō)明不同炮制品對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH的清除能力不同，其順序?yàn)楫?dāng)歸碳＞酒當(dāng)歸＞土當(dāng)歸＞生當(dāng)歸＞油當(dāng)歸。

表1 當(dāng)歸不同炮制品醇提液對(duì)羥自由基的清除作用Tab.1 The scavenging effect of ethanol extracts from processed products of Radix Angelicae sinensi on ·OH(±s)

表1 當(dāng)歸不同炮制品醇提液對(duì)羥自由基的清除作用Tab.1 The scavenging effect of ethanol extracts from processed products of Radix Angelicae sinensi on ·OH(±s)

注:a，b……表示同一炮制品不同濃度之間比較，不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，相同字母，表示差異不顯著(P＞0.05)。

濃度/(mg/mL)清除率/%生當(dāng)歸 油當(dāng)歸 酒當(dāng)歸 土當(dāng)歸 當(dāng)歸炭20 4.01±0.60a 19.82±0.53a 21.89±1.72a 14.19±2.68a 26.29±0.71a 40 12.24±1.19b 25.34±1.50b 27.82±0.78b 20.08±0.21b 41.46±0.13b 80 37.59±0.84c 42.50±0.96c 47.14±1.22c 48.31±2.12c 56.76±0.15c 160 79.00±0.50d 59.91±1.12d 78.60±0.42d 78.87±0.02d 95.22±2.12d

3.2 當(dāng)歸炮制品醇提液對(duì)氧自由基的清除作用

由表2可知，當(dāng)歸不同炮制品醇提液對(duì)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系產(chǎn)生的氧自由基(O-2)均有一定的清除作用，并隨著濃度的增加，抑制率明顯升高(P＜0.05)，呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系，由不同炮制品半數(shù)抑制率(IC50)從小到大依次為當(dāng)歸炭、生當(dāng)歸、酒當(dāng)歸、土當(dāng)歸和油當(dāng)歸，見(jiàn)圖1。說(shuō)明不同炮制品對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的O-2的清除能力不同，其順序?yàn)楫?dāng)歸炭＞生當(dāng)歸≈酒當(dāng)歸＞土當(dāng)歸＞油當(dāng)歸。

表2 當(dāng)歸不同炮制品對(duì)氧自由基的清除作用Tab.2 The scavenging effect of ethanol extracts from processed products of Radix Angelicae sinensi on(±s)

表2 當(dāng)歸不同炮制品對(duì)氧自由基的清除作用Tab.2 The scavenging effect of ethanol extracts from processed products of Radix Angelicae sinensi on(±s)

注:a，b……表示同一炮制品不同濃度之間比較，不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，相同字母，表示差異不顯著(P＞0.05)。

濃度/(mg/mL)清除率/%生當(dāng)歸 油當(dāng)歸 酒當(dāng)歸 土當(dāng)歸 當(dāng)歸炭25 18.33±0.15a 15.64±0.82a 10.47±0.36a 17.73±1.71a 21.92±1.86a 50 26.73±0.45b 24.76±1.34b 22.93±1.70b 25.60±0.88b 31.35±0.45b 100 71.91±1.14c 36.62±0.86c 72.10±1.17c 45.65±0.27c 83.10±1.72c 200 82.48±0.87d 72.59±1.16d 84.52±1.91d 77.65±0.45d 90.78±0.29d

3.3 當(dāng)歸炮制品指紋峰的建立及定量 按上述液相色譜條件測(cè)定了當(dāng)歸及其炮制品樣品，根據(jù)各樣品圖譜中色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，鑒定了11個(gè)共有峰，見(jiàn)圖2。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品阿魏酸的色譜峰保留時(shí)間，鑒定峰1為阿魏酸，將共有峰的紫外光譜與文獻(xiàn)相比較［11-12］，推測(cè)峰2-11依次為洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、未知、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、丁基酜內(nèi)酯，E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯、Z-丁烯基酞內(nèi)酯、levistolide A.。計(jì)算共有峰的峰面積，見(jiàn)表3，建立當(dāng)歸指紋圖譜。

圖1 當(dāng)歸炮制品醇提液對(duì)羥自由基和氧自由基的IC50Fig.1 IC50of ethanol extracts from angelica processed products on·OH and

圖2 當(dāng)歸不同炮制品飲片HPLC指紋色譜圖Fig.2 HPLC fingerprint chromatograms of angelica processed products

表3 當(dāng)歸炮制品共有峰峰面積Tab.3 The peak area of common peaks of processed products of Radix Angelicae sinensi

3.4 當(dāng)歸炮制品清除自由基的譜效關(guān)系 采用SPSS 13.0軟件當(dāng)歸炮制品半數(shù)清除率(IC50)與11個(gè)共有峰峰面積進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果表明，有4個(gè)與清除羥自由基密切相關(guān)的色譜峰被引人回歸方程，它們依次為1、4、7、10色譜峰所代表的化合物，每個(gè)變量的回歸系數(shù)分別為0.236、-0.384、0.306、1.512。多元線性回歸方程為:Y=0.236X1-0.384X4+0.306X7+1.512X10-213.219。有 4 個(gè)與清除氧自由基密切相關(guān)的色譜峰被引入回歸方程，它們依次為峰3、4、10、11色譜峰所代表的化合物，每個(gè)變量的回歸系數(shù)分別為0.987、-1.982、0.757、-0.009。多元線性回歸方程為:Y=25.247+0.987 3X3-1.982X4+0.757X10-0.009X11

4 討論

自由基學(xué)說(shuō)是由Harman于1957年提出的。自此以后，自由基生物學(xué)和自由基醫(yī)藥學(xué)得到了長(zhǎng)足發(fā)展，推動(dòng)了人類對(duì)衰老、腫瘤、炎癥、動(dòng)脈硬化、血栓形成、缺血性疾病形成機(jī)理的深入研究。許多研究顯示，當(dāng)器官組織缺血缺氧時(shí)，機(jī)體將通過(guò)激素、遞質(zhì)、酶系三者進(jìn)行細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的權(quán)宜性調(diào)節(jié)，從而產(chǎn)生大量自由基［13］?？梢?jiàn)自由基對(duì)人體造成損害與血虛證和血瘀證之間具有密切的關(guān)系。當(dāng)歸能補(bǔ)血活血，主治血虛和血瘀等證，其炮制品有酒當(dāng)歸、土當(dāng)歸、油當(dāng)歸和當(dāng)歸炭，前人有“油當(dāng)歸偏于養(yǎng)血潤(rùn)腸，酒當(dāng)歸偏于活血、當(dāng)歸炭偏于止血”之說(shuō)。為此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了當(dāng)歸不同炮制品清除自由基實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明不同濃度當(dāng)歸炮制品醇提液對(duì)羥自由基和氧自由基都有一定的清除作用，隨濃度的增大，清除率顯著增高，呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系;并且不同炮制品清除羥自由基和氧自由基的能力各不相同，其中當(dāng)歸炭清除自由基的效果最好，酒當(dāng)歸次之，說(shuō)明當(dāng)歸炭偏于止血，酒當(dāng)歸偏于活血具有一定的道理。

目前，中藥指紋圖譜與藥效關(guān)系的數(shù)據(jù)處理方法主要包括多元線性回歸分析、多元非線性回歸、主成分分析、聚類分析以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法。如錢俊等采用雙變量相關(guān)分析方法研究了加味四妙丸譜效關(guān)系，明確加味四妙丸有效部位群中指紋圖譜共有峰與組方藥材有效部位及藥效的相關(guān)性，表征加味四妙丸有效部位群藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［14］。盧紅梅等用聚類分析方法探討了魚腥草注射液質(zhì)量控制中的譜效學(xué)關(guān)系［15］。梁生旺等用回歸分析研究方法找出金銀花中與抗炎活性成正相關(guān)的化學(xué)成分，并以此建立金銀花的藥效指紋圖譜［16］。本實(shí)驗(yàn)采用多元線性回歸法對(duì)當(dāng)歸炮制品清除自由基的譜效關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明峰10所代表的化合物Z-丁烯基酞內(nèi)酯和峰4所代表的未知化合物與羥自由基和氧自由基的清除密切相關(guān)，其中峰10呈正相關(guān)關(guān)系，而峰4呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。阿魏酸、丁基酜內(nèi)酯僅與清除羥自由基密切相關(guān)，而洋川芎內(nèi)酯H和levistolide A.與清除氧自由基密切相關(guān)。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986.

［2］康 軍.當(dāng)歸化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展［J］.醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)資訊，2005，(23):120.

［3］孟同風(fēng)，何 莉.當(dāng)歸炮制研究初探［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，24(5):52.

［4］鄧紅娟，郭延生，曲亞玲，等.生當(dāng)歸、酒當(dāng)歸和油當(dāng)歸體外清除自由基活性研究［J］.中草藥，2009，40(5):784-787.

［5］鄧紅娟，郭延生，刁鵬飛，等.當(dāng)歸水提液和醇提液體外清除自由基的研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44(4):58-61.

［6］刁鵬飛，郭延生，劉寶劍，等.當(dāng)歸水提液和醇提液體外抗脂質(zhì)過(guò)氧化和紅細(xì)胞溶血作用［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2009，21:679-683.

［7］羅國(guó)安，王義明.多維多信息特征譜及應(yīng)用［J］.中成藥，2000，22(6):395-397.

［8］梁逸曾，龔 范，俞汝勤.化學(xué)計(jì)量學(xué)用于中醫(yī)藥研究［J］.化學(xué)進(jìn)展，1999(11):208-212.

［9］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:89.

［10］甘肅省衛(wèi)生廳.甘肅中藥炮制規(guī)范［M］.蘭州:甘肅人民出版社，1999:53.

［11］吳燕燕，尚明英，蔡少青.當(dāng)歸的化學(xué)成分指紋圖譜［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43(7):728-732.

［12］Lu GH，Kelvin C，Liang YZ，et al.Development of high performance liquid chromatographic fingerp rints for distinguishing Chinese Angelica from related Umbelliferae herbs［J］.J Chromatogr A，2005，1073:383-392.

［13］劉 勁，曲長(zhǎng)江.自由基與中醫(yī)學(xué)的氣、血、精［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1999，5(12):16-20.

［14］錢 俊，尹 蓮.加味四妙丸有效部位群HPLC指紋圖譜歸屬分析及譜效關(guān)系研究［J］.世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9(1):40-45.

［15］盧紅梅，梁逸曾，錢 頻.魚腥草注射液質(zhì)量控制中的譜效學(xué)初步探討［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40(12):1147-1150.

［16］梁生旺，崔永霞，王淑美，等.金銀花的藥效指紋圖譜研究［J］.中草藥，2006，37(10):1489-1493.