侯玉華， 鄭 敏， 叢曉東， 孔 艷

(1.江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校，江蘇徐州221116;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053;3.徐州市中醫(yī)院，江蘇 徐州221000)

白斑酊(簡(jiǎn)稱本品，下同)是徐州市中醫(yī)院制劑室制劑(批準(zhǔn)文號(hào):蘇藥制字Z04001904)，由補(bǔ)骨脂、菟絲子、梔子等多味藥材組成，具有滋補(bǔ)肝腎，涼血解毒。臨床上主要用來(lái)治皮膚白斑，白癜風(fēng)，斑禿等癥。原標(biāo)準(zhǔn)過于簡(jiǎn)單，無(wú)含量測(cè)定，為提高本品的內(nèi)在質(zhì)量，增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)的約束力，在參考其他文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上［1-3］，建立反相高效液相色譜法對(duì)白斑酊中3種主要藥效成分(梔子苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素)含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-20A型紫外檢測(cè)器，CTO-10A S vp型柱溫箱，CBM-102型工作站。RE-52A旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn))，電子天平(BS224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，HS6150D超聲提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)。梔子苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)，梔子苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品批號(hào):110749-200714，110739-200814，110738-200410，白斑酊為徐州市中醫(yī)院制劑室提供，白斑酊批號(hào) 090517、090529、100301，甲醇為色譜純(天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)，乙腈(進(jìn)口乙腈HPLC/spectro As1122-001)，水為哇哈哈純凈水，所用其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱SHMADZU shim-pack-vp-ODS(150 mm×4.6 mm serial NO 8042464);柱溫:室溫;流動(dòng)相:乙腈-水梯度洗脫，0～10 min(13:87～20:80)，10～35 min(20:80～50:50)，35～45 min(50:50)。流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):238 nm;進(jìn)樣量由定量環(huán)控制為20 μL;理論塔板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。在此條件下，梔子苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素保留時(shí)間分別為4.3 min、28.3 mim、29.2 min，與相鄰成分達(dá)到基線分離，與其它相鄰色譜峰分離度均大于1.5，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取梔子苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量，加甲醇分別配制成為 0.059 6 mg/mL、0.051 9 mg/mL、0.055 4 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密吸取上述對(duì)照品貯備液各10 mL、0.5 mL、0.5 mL于25 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻制成梔子苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素濃度為 0.023 8 mg/mL、0.001 04 mg/mL、0.001 10 mg/mL的對(duì)照品混合溶液，供含量測(cè)定用。

2.2.2 樣品溶液制備 精密吸取白斑酊樣品2 mL，用甲醇稀釋50倍，0.45 μm微孔濾膜濾過即得。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 分別配制缺梔子、補(bǔ)骨脂的處方藥材，按處方及工藝要求制備陰性樣品，照供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

圖1 白斑酊HPLC譜圖

2.3 線性關(guān)系、檢出限(LOD)、測(cè)定限(LOQ)考察

分別精密吸取上述對(duì)照品混合溶液1、2、3、4、5、6 mL于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，按上述色譜條件分別進(jìn)樣20 μL記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)得回歸方程為:梔子苷Y=1×10-6X+1 708.5，r=0.999 4，線性范圍0.048 0 μg ～0.286 μg。補(bǔ)骨脂素 Y=1 ×10-7X-1 647.1，r=0.999 4，線性范圍0.002 10 μg～0.012 5 μg。異補(bǔ)骨脂素 Y=6×10-6X-676，r=0.999 2，線性范圍 0.002 20 μg～0.013 3 μg。用所選擇的條件，取實(shí)際樣品稀釋后進(jìn)樣，當(dāng)信噪比(S/N)≥3時(shí)，檢出限(LOD):梔子苷0.03 ng，補(bǔ)骨脂素0.04 ng，異補(bǔ)骨脂素0.04 ng。當(dāng)信噪比(S/N)≥10時(shí)，測(cè)定限(LOQ):梔子苷0.08 ng，補(bǔ)骨脂素0.08 ng，異補(bǔ)骨脂素0.14 ng。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液20 μL(梔子苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素濃度分別為11.9 μg/mL，0.520 μg/mL，0.555 μg/mL)，按上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算RSD值，結(jié)果梔子苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素RSD(%)分別為2.3%、0.9%、0.7%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品制成供試品溶液，精密量取 20 μL，分別在0、1、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果梔子苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素分別為:0.62%、0.59%、0.92%。表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足含量測(cè)定要求。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批樣品(批號(hào)090517)精密移取6份，分別按樣品測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算RSD值，結(jié)果測(cè)得梔子苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素平均含量分別為 0.482、0.018、0.020 mg/mL，梔子苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素RSD分別為0.21%、1.9%、2.7%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取白斑酊(批號(hào)090517含量:梔子苷為0.481 mg/mL，補(bǔ)骨脂素為0.018 mg/mL，異補(bǔ)骨脂素為0.020 mg/mL)9份，每份1.0 mL，分成3組，每組3份分別精密加入含梔子苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素(0.023 84 mg/mL、0.001 04 mg/mL、0.001 11 mg/mL)對(duì)照品混合液各18、19、20 mL，按樣品操作方法項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及RSD值，結(jié)果測(cè)得梔子苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的平均回收率分別為:96.32%、97.95%、97.52%，RSD分別為1.3%、0.60%、1.2%(n=9)。見表1～3。

表1 梔子苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 補(bǔ)骨脂素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表3 異補(bǔ)骨脂素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.8 樣品測(cè)定 取3批白斑酊，按2.2項(xiàng)下樣品溶液制備方法操作，制成樣品溶液，取樣品溶液與對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中梔子苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量即得。結(jié)果見表4。

表4 白斑酊的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 色譜條件選擇 文獻(xiàn)［1］梔子苷含量測(cè)定流動(dòng)相乙腈-水(11:89)等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm，文獻(xiàn)［2-3］中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量測(cè)定流動(dòng)相甲醇-水等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。因此在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，取2.2.2項(xiàng)下樣品溶液經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用乙腈-水(梯度洗脫)，3組份同時(shí)檢出，干擾組份少，各組份與相鄰成分達(dá)到基線分離，出峰時(shí)間、峰形、柱效均較為滿意，結(jié)果穩(wěn)定，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。為確保檢測(cè)靈敏度，于不同波長(zhǎng)下進(jìn)行分析，結(jié)果在波長(zhǎng)238 nm下三者的檢測(cè)靈敏度均較好，峰面積變化小，故本實(shí)驗(yàn)選用238 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定3種組份的含量。

3.2 溶劑選擇 本實(shí)驗(yàn)分別采用50%乙醇，50%甲醇，100%甲醇作溶劑，50%乙醇為溶劑時(shí)，但基線往下漂移，穩(wěn)定性差，溶劑峰干擾梔子苷峰，50%甲醇、100%甲醇作溶劑樣品峰型均好，但50%甲醇過濾不易。綜合以上原因，選用100%甲醇為溶劑所得的梔子苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量最大，效果最佳。同時(shí)檢出成分比較少，使梔子苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素易于檢出。

3.3 方法不足 如有條件盡可能多的得到對(duì)照品種類，在同一色譜條件下對(duì)其進(jìn)行3組份以上含量測(cè)定，全面提升白斑酊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)水平。

［1］蔣 渝.消腫止痛膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.藥物鑒定，2007，16(13):23-24.

［2］周吳萍，梁 丹，韋海園.HPLC法同時(shí)測(cè)定白癜風(fēng)膠囊中2種成分含量的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(25):10745-10746.

［3］成光宇，胡 榮.高效液相色譜法測(cè)定白癜風(fēng)顆粒中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量［J］.中藥現(xiàn)代化，2008，28(12):920.