曾祖平， 劉 釗， 張 虎， 何 薇， 王 宏， 王永紅

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所，北京100010)

芙蓉膏為北京中醫(yī)醫(yī)院皮外科常用的傳統(tǒng)軟膏劑，由黃連、黃芩、大黃等藥味組成，具有清熱解毒，活血消腫的功效，主治丹毒、蜂窩組織炎、癤、癰初起等［1］。原制劑為藥材粉碎后直接加入凡士林基質中，藥材有效成分利用度低，軟膏油膩，易污染衣物。為提高其臨床療效，便于使用，我們將芙蓉膏改進為凝膠劑，對其工藝進行了研究［2］。本實驗建立了芙蓉凝膠的質量標準。

1 材料和儀器

芙蓉凝膠(自制);芙蓉凝膠藥材飲片(北京杏林藥業(yè)有限責任公司);鹽酸小檗堿對照品(批號110713-200208，含量測定用)、黃芩苷對照品(批號110715-200514，含量測定用)、鹽酸巴馬汀對照品(批號:110732-200907，按鹽酸巴馬汀為86.1% 計，供含量測定用)、大黃素(批號756-9707)、大黃素甲醚(批號758-9301)、大黃酸(批號0757-200206)、大黃酚(批號 796-9303)、蘆薈大黃素(批號 795-9301)、熊果酸(批號 110742-200516)、漢黃芩素(1514-200202)、掌葉大黃對照藥材、黃連對照藥材、關黃柏對照藥材、黃芩對照藥材均購自中國藥品生物制品檢定所;水為重蒸水;甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，硅藻土為化學純，其余試劑為分析純;濾膜(孔徑0.45 μm ，德國 MEMBRANA 公司)。

1100系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司，包括二元泵、自動進樣器、多波長檢測器)，AJ150L電子精密天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，SK7210HP型KUDOS超聲波清洗機(上?？茖С晝x器有限公司)，SNB-2型數字旋轉黏度計(上海地學儀器研究所)，JC402PH/Mv智能式數字顯示酸度計(北京創(chuàng)業(yè)儀器廠)。

2 方法與結果

2.1 性狀 本品為棕黃色稠厚液體。

2.2 鑒別

2.2.1 澤蘭的薄層色譜鑒別［3］157取本品5 g，加硅藻土5 g分散，晾干，加入乙醚30 mL，超聲10 min，濾過;濾渣備用;濾液揮去溶劑，殘渣用甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。按處方配比稱取除澤蘭以外的其它藥材，按芙蓉凝膠制備方法制備凝膠，并按供試品溶液的制備方法制備澤蘭陰性對照液。另取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一含0.3%羧甲基纖維素鈉的硅膠G板上，以環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，熱風吹至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同紫紅色斑點;365 nm下顯相同橙黃色熒光斑點，陰性對照無干擾，見圖1。

圖1 澤蘭的薄層色譜圖Fig.1 TLC of Herba Lycopi

2.2.2 大黃的薄層色譜鑒別［3］17供試品溶液制備同2.2.1項;同2.2.1項中方法制備大黃陰性對照液。另取掌葉大黃對照藥材粉末0.1 g，加甲醇20 mL，浸泡1 h，濾過，取濾液5 mL，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。再取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚和大黃素對照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液;再吸取上述對照品溶液各1 mL，混勻，作為對照品溶液。照《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL、對照藥材和對照品溶液各5 μL，分別點于同一含0.3%羧甲基纖維素鈉的硅膠H板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應位置上，顯相同5個橙黃色熒光斑點;置氨蒸氣熏后，斑點變?yōu)榧t色，陰性對照無干擾，見圖2。

圖2 大黃的薄層色譜圖Fig.2 TLC of Radix et Rhizoma Rhei

2.2.3 黃連、關黃柏的薄層色譜鑒別［4］2.2.1項中乙醚提取后的濾渣揮盡溶劑，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)50 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣用甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。按處方配比稱取除黃連、關黃柏藥材以外的其它藥材，按芙蓉凝膠制備方法制備凝膠，并按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。另取黃連對照藥材、關黃柏對照藥材各0.1 g，分別加甲醇10 mL，超聲處理20 min，濾過，作為對照藥材溶液。再取鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品，分別加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。再取上述兩種對照品溶液等比例混合，作為混合對照品溶液。照《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、陰性對照溶液各5 μL、對照藥材溶液、對照品溶液和混合對照品溶液各1μL，分別點于同一含0.3%羧甲基纖維素鈉的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3 ∶3.5 ∶1 ∶1.5∶0.5∶1)為展開劑，加入展開箱一側槽中，另側槽加入與展開劑等體積的濃氨試液共同預平衡20 min，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應位置上，顯相同黃色熒光斑點，陰性對照無干擾，見圖3。

圖3 黃連、關黃柏的薄層色譜圖Fig.3 TLC of Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri Amurensis

2.2.4 黃芩的薄層色譜鑒別 供試品溶液制備同2.2.1項。同2.2.1項中方法制備黃芩陰性對照液。另取黃芩對照藥材0.1 g，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)4 mL，浸泡 1 h，超聲處理 30 min，濾過，蒸干，殘渣用甲醇1 mL溶解，作為對照藥材溶液。照《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗，再取漢黃芩素對照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL、對照藥材和對照品溶液各2 μL，分別點于同一含0.3%羧甲基纖維素鈉的硅膠G板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應位置上，有相同的暗綠色斑點，陰性對照無干擾，見圖4。

圖4 黃芩的薄層色譜圖Fig.4 TLC of Radix Scutellariae

2.3 檢查

2.3.1 pH值 取本品1 g，稱定，加蒸餾水10 mL使溶解，照《中國藥典》2005年版一部附錄ⅦG pH值測定法試驗，pH值為5.50～6.50。

2.3.2 黏度 照《中國藥典》2005年版二部附錄ⅥG黏度測定法中第二法測定，動力黏度為8 500～12 500 mPa·s。

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil 100-5C18(150 mm×4.6 mm);流動相:乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀-三乙胺(25∶75∶0.2);流速:1.0 mL/min;檢測波長:276 nm(黃芩苷)，265 nm(鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿);柱溫:室溫;理論板數按黃芩苷峰計算不低于2 500，按鹽酸巴馬汀計算不低于4 000，按鹽酸小檗堿計算不低于3 000。

2.4.2 對照品溶液的制備及線性關系 精密稱取已干燥(60℃減壓干燥4 h)的黃芩苷對照品0.012 6 g，用甲醇定容于10 mL量瓶中，制成濃度為1.26 mg/mL的黃芩苷對照品貯備液;分別精密稱取已干燥(100℃干燥5 h)的鹽酸巴馬汀對照品0.010 0 g、鹽酸小檗堿對照品0.013 0 g，用甲醇分別定容于25 mL量瓶中，分別制成濃度為0.344 4 mg/mL的鹽酸巴馬汀對照品貯備液和0.52 mg/mL的鹽酸小檗堿對照品貯備液。精密吸取上述黃芩苷對照品貯備液2 mL、鹽酸巴馬汀對照品貯備液3 mL和鹽酸小檗堿對照品貯備液5 mL于同一10 mL量瓶中，制成黃芩苷(0.252 mg/mL)、鹽酸巴馬汀(0.103 3 mg/mL)和鹽酸小檗堿(0.26 mg/mL)混合對照品溶液。分別進樣 0.2、0.5、1、2、4 μL，按上述色譜條件測定，記錄黃芩苷(276 nm)和鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿(265 nm)峰面積，分別以黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積積分值(Y)為縱坐標，以進樣質量為橫坐標(X)，進行線性回歸，回歸方程分別為黃芩苷:Y=3 562.3X+10.646(r=0.999 7)，鹽酸巴馬汀:Y=4 114.3X+52.091(r=0.999 6)，鹽酸小檗堿:Y=4 607.6X-76.822(r=0.999 8)，表明黃芩苷在0.050 4～1.008 μg范圍、鹽酸巴馬汀在0.020 7～0.413 3 μg范圍、鹽酸小檗堿在0.052～1.04 μg范圍內呈良好的線性關系。色譜圖見圖5。

圖5 黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿標準品HPLC圖譜Fig.5 HPLC of berberine hydrochloride，palmatin hydrochloride and baicalin

2.4.3供試品溶液制備 取芙蓉凝膠約2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密稱取等量硅藻土于同一錐形瓶中，將二者混合分散均勻;取混合物約0.4 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入流動相10 mL，稱定重量，超聲處理40 min，取出，放冷，再稱定重量，用流動相補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.4 方法學考察

2.4.4.1 穩(wěn)定性試驗:取凝膠的同一供試品溶液，每隔1 h左右進樣測定1次，連續(xù)測定6個小時，結果黃芩苷RSD=1.09%，鹽酸巴馬汀RSD=1.35%，鹽酸小檗堿RSD=1.40%，表明6 h內黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿基本穩(wěn)定。

2.4.4.2 精密度試驗:同一供試品溶液，連續(xù)進樣5次，記錄黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的峰面積，計算黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為0.53%、0.42%和0.44%(n=5)，表明儀器精密度符合要求。

2.4.4.3 專屬性試驗:按處方比例分別制備不含黃連、黃柏的凝膠和不含黃芩的凝膠，照2.4.3項方法制備黃連、黃柏和黃芩的陰性對照溶液，測定，結果顯示在與黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿保留時間相應的位置上未見相關吸收峰，說明本品中其他成分對黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的測定無干擾。色譜圖見圖6，7。

圖6 黃芩陰性HPLC圖譜Fig.6 HPLC of blank of Radix Scutellariae

圖7 黃連、關黃柏陰性HPLC圖譜Fig.7 HPLC of blanks of Rhizoma Coptidis and Cortex Phellodendri Amurensis

2.4.4.4 重復性試驗:取同一批芙蓉凝膠，共6份，按2.4.3項方法制備供試品溶液，按2.4.1項色譜條件進行測定。結果芙蓉凝膠中黃芩苷含量RSD=1.14%(n=6)，鹽酸巴馬汀含量RSD=1.37%(n=6)，鹽酸小檗堿含量 RSD=1.57%(n=6)，表明方法重復性良好。色譜圖見圖8。

圖8 芙蓉凝膠樣品HPLC圖譜Fig.8 HPLC of sample of Furong Gel

2.4.4.5 回收率試驗:精密吸取黃芩苷對照品貯備液4 mL、鹽酸巴馬汀對照品貯備液4 mL和鹽酸小檗堿對照品貯備液6 mL于同一25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得黃芩苷(0.201 6 mg/mL)、鹽酸巴馬汀(0.055 1 mg/mL)和鹽酸小檗堿(0.124 8 mg/mL)混合對照品溶液。取芙蓉凝膠約2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密稱取等量硅藻土于同一錐形瓶中，將二者混合分散均勻;取混合物約0.2 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入流動相9.5 mL、混合對照品溶液0.5 mL，其余操作同2.4.3項供試品溶液的制備，按2.4.1項色譜條件進行測定。分別計算回收率，結果平均回收率黃芩苷為101.49%，RSD為1.18%(n=6)，鹽酸巴馬汀為100.49%，RSD為0.87%(n=6)，鹽酸小檗堿為101.23%，RSD為1.42%(n=6)。結果見表1。

表1 回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery test

2.4.5 樣品測定 取3批樣品，按供試品溶液制備方法制成供試液，精密吸取對照品溶液0.5 μL，供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，計算黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量。結果見表2。

表2 芙蓉凝膠中黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量測定結果Tab.2 Contents of berberine hydrochloride，palmatin hydrochloride and baicalin in Furong Gel

3 討論

3.1 曾經針對芙蓉葉中的蘆丁等黃酮類成分進行了薄層層析鑒別，但陰性對照有干擾，高效液相色譜也顯示陰性對照液中含有蘆丁，與澤蘭中含有蘆丁成分的文獻記載相符，故放棄。研究澤蘭薄層層析時以熊果酸和齊墩果酸作為陽性對照，嘗試了多種供試液制備方法和展開劑種類，目前的條件干擾小、斑點清晰，但仍不能分離熊果酸和齊墩果酸，原因是二者為同分異構體，化學性質極其相近。鑒別黃芩時，嘗試了多種吸附劑和展開劑，制劑中的基質和其它成分總有干擾;現(xiàn)針對黃酮苷元成分進行鑒別，采用現(xiàn)行展開劑，可鑒別多種成分，斑點較為清晰。

3.2 含量測定時，分別對提取溶劑種類及用量、提取方法及時間進行了單因素考察，優(yōu)選出的條件對芙蓉凝膠中黃芩苷和鹽酸小檗堿的提取率高;HPLC分析時嘗試過多種流動相，目前采用的流動相分離度、對稱性等符合要求，可同時測定芙蓉凝膠中黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量。

［1］張志禮.中西醫(yī)結合皮膚性病學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:526.

［2］曾祖平，喬文越，劉 然，等.芙蓉凝膠的研制［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2009，29(19):15-18.

［3］中國藥典［S］.一部.2005.

［4］藥典委員會.中華人民共和國藥典中藥薄層色譜彩色圖集［M］.廣州:廣東科技出版社，1993:70-71.