謝麗玲， 趙闖營， 易偉萍， 朱炎坤， 任 理， 曹俊輝

(汕頭大學(xué)生物系，廣東汕頭515063)

夾竹桃(Nerium indicum Mill)系龍膽目夾竹桃科夾竹桃屬植物，長綠灌木，原產(chǎn)伊朗、印度，現(xiàn)廣分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，中國各省區(qū)皆有栽培。據(jù)中藥大辭典記載，其葉、皮可入藥，味苦，性寒，有毒;強(qiáng)心，鎮(zhèn)痛，歸心經(jīng)，為強(qiáng)心類藥物。藥用植物的多糖具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化等多方面的功效［1］。目前國內(nèi)外對(duì)夾竹桃的研究大多是關(guān)于夾竹桃苷［2-5］，而對(duì)夾竹桃多糖的研究報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)在原實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)夾竹桃葉多糖的分離純化及光譜分析做了系統(tǒng)研究。優(yōu)化了多糖的乙醇沉淀工藝，對(duì)比了除蛋白和脫色方法，得出最佳的醇沉工藝和除蛋白、脫色方法，并對(duì)分離純化后的精多糖進(jìn)行了光譜分析。

1 材料與儀器

1.1 材料 采摘汕頭地區(qū)新鮮的夾竹桃葉片，經(jīng)鑒定后烘箱中50℃烘干，粉碎、過20目篩后備用。

1.2 儀器與試劑

主要儀器:CR22GⅡ型日立超速冷凍離心機(jī)，UV-2102C型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)，傅立葉變換紅外光譜儀(美國尼高力(Nicolet)公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，SBSZ100數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)，不同規(guī)格層析柱。

試劑:DEAE-52纖維素(Whatman分裝)，Sephadex G-200(上?；瘜W(xué)試劑廠，Pharmacia進(jìn)口分裝)，其它均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 多糖含量和蛋白含量的測(cè)定 多糖含量采用苯酚-硫酸法［6］，蛋白含量測(cè)定采用 Bradford 法［7］。

2.2 多糖的提取 采用熱水提取法，在原有實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)定提取溫度88.2℃，提取時(shí)間3 h，料液比1∶45，在此條件下提取兩次，抽濾并濃縮7.5倍后得濃縮液。

2.3 乙醇沉淀工藝條件的確定［8-9］

2.3.1 醇沉濃度的確定 準(zhǔn)確移取10 mL濃縮液5份，分別加入1、2、3、4、5BV 的無水乙醇放入4 ℃冰箱1 h，4 000 r/min離心5 min，沉淀用無水乙醇洗滌3次，水浴揮去有機(jī)溶劑至沉淀為粉末狀，沉淀分別加入5 mL蒸餾水溶解后測(cè)定蛋白含量，稀釋5倍后測(cè)定多糖含量。

2.3.2 醇沉?xí)r間的確定 準(zhǔn)確移取10 mL濃縮液5份，加入2.3.1項(xiàng)中確定的乙醇倍數(shù)后放入4℃冰箱，分別放置 2、4、6、8、10 h，4 000 r/min 離心 5 min，沉淀用無水乙醇洗滌3次，水浴揮去有機(jī)溶劑至沉淀為粉末狀，沉淀分別加入5 mL蒸餾水溶解后測(cè)定蛋白含量，稀釋5倍后測(cè)定多糖含量。

將濃縮液按上述確定的最佳條件處理后得到的多糖溶于蒸餾水后可得粗多糖液，粗多糖液再經(jīng)濃縮醇沉，水浴蒸干沉淀中殘留的有機(jī)溶劑至粉末狀即得粗多糖。

2.4 多糖中蛋白的去除［10-12］

2.4.1 Sevag法 取粗多糖液30 mL，加入10 mL Sevag試劑充分振蕩30 min，靜置1 h，待有機(jī)溶劑揮發(fā)后，分液去除下層白色沉淀，重復(fù)操作4次后測(cè)定上層多糖液中多糖和蛋白含量，計(jì)算多糖的損失率和蛋白的去除率。

2.4.2 TCA法 取粗多糖液30 mL，用10%三氯乙酸(TCA)調(diào)至pH 4，放入4℃冰箱靜置4 h，9 000 r/min離心10 min，調(diào)至pH 7，測(cè)定上清液中多糖和蛋白含量，并計(jì)算多糖的損失率和蛋白的去除率。

2.5 多糖液中色素的脫除［12-13］

2.5.1 脫色率的計(jì)算 根據(jù)多糖溶液脫色前后均為橙黃色，故從溶液的互補(bǔ)色考察選擇450 nm為檢測(cè)波長，以蒸餾水作參比，測(cè)定其吸光度。

按下式計(jì)算脫色率:

脫色率=(脫色前吸光度-脫色后吸光度)/脫色前吸光度×100%

2.5.2 活性炭脫色 參照文獻(xiàn)選取最佳條件為:40℃，調(diào)pH 5，加入2%活性炭，攪拌20 min，過濾后調(diào)至pH 7，計(jì)算多糖脫色率和損失率。

2.5.3 H2O2脫色 參照文獻(xiàn)選取最佳條件為:40～50 ℃，調(diào) pH8 ～9，加入20%H2O2，脫色4 h，調(diào)至pH 7，計(jì)算多糖脫色率和損失率。

2.5.4 大孔樹脂AB-8柱層析脫色 取100 mL待脫色的多糖液上樣，以2倍柱床體積/小時(shí)的速度，蒸餾水洗脫5倍柱體積后，洗脫液濃縮定容至100 mL，計(jì)算多糖脫色率和損失率。

2.6 多糖液的透析 將多糖液轉(zhuǎn)至處理好的透析袋(截留分子量＞8 000)中，對(duì)蒸餾水透析，每隔4 h換水一次，48 h即可去除殘留的小分子和離子。

2.7 多糖液的柱層析分離純化［14-16］

2.7.1 DEAE-52纖維素柱層析 DEAE-52纖維素柱層析按照階段性梯度洗脫和線性梯度洗脫兩種洗脫方式進(jìn)行。階段性梯度洗脫利用濃度由小到大的NaCl溶液依次進(jìn)行連續(xù)過柱洗脫，NaCl濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L。線性梯度洗脫，采用洗脫能力連續(xù)性逐漸增強(qiáng)的NaCl溶液，即濃度線性增大的NaCl溶液，進(jìn)行柱洗脫。層析柱規(guī)格1×60 cm，洗脫液采用部分收集器自動(dòng)收集，流速為0.5 mL/min，每管10 min，直至無糖檢出為止，隔管檢測(cè)繪制洗脫曲線。

2.7.2 Sephadex G-200凝膠柱層析 經(jīng)DEAE-52柱層析分離的多糖，濃縮透析后進(jìn)行Sephadex G-200凝膠柱層析進(jìn)一步純化。層析柱規(guī)格2.6 cm×40 cm，0.1 mol/L NaCl溶液洗脫，洗脫液采用分布收集器自動(dòng)收集，流速為0.5 mL/min，每管10 min，直至無糖檢出為止，隔管檢測(cè)繪制洗脫曲線。

將所得的洗脫液主峰部分合并，再經(jīng)濃縮透析脫鹽，即得精多糖液，精多糖液再經(jīng)醇沉，水浴蒸干沉淀中殘留的有機(jī)溶劑至粉末狀即得精多糖。

2.8 夾竹桃葉多糖的光譜分析［17-19］

2.8.1 紫外光譜掃描 將粗多糖液和精多糖液分別以蒸餾水為參比，在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行200～400 nm范圍掃描。

2.8.2 紅外光譜分析 稱取粗多糖和精多糖粉末各2 mg，加入200 mg干燥的KBr晶體，在紅外燈照射下于研缽中輕輕研磨至極細(xì)，用壓光機(jī)壓片，經(jīng)紅外分光光度計(jì)400～4 000 cm-1紅外區(qū)掃描，測(cè)定透光率曲線。

3 結(jié)果及分析

3.1 乙醇沉淀工藝的確定

3.1.1 醇沉濃度對(duì)多糖含量的影響 加入4倍無水乙醇即使溶液中乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)結(jié)果最為理想，乙醇濃度過低會(huì)降低多糖的沉淀量，過高將造成多糖的黏度增大，不宜分離。綜合考慮，以加入4倍量乙醇為佳，結(jié)果如圖1。

圖1 不同醇沉濃度對(duì)多糖及蛋白含量的影響

3.1.2 醇沉?xí)r間對(duì)多糖含量的影響 醇沉?xí)r間增加，多糖量也隨之增加，但8 h后多糖增加趨勢(shì)顯著變緩，綜合考慮，以醇沉8 h為宜，結(jié)果如圖2。

圖2 不同醇沉?xí)r間對(duì)多糖及蛋白含量的影響

3.1.3 乙醇沉淀工藝條件的驗(yàn)證 加入4倍無水乙醇即使溶液中乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，乙醇沉淀時(shí)間為8 h時(shí)，多糖回收率為93.47%。

3.2 蛋白的去除 TCA法除蛋白，無論是多糖保留率還是蛋白去除率效果均優(yōu)于Sevag法，且TCA法操作簡單，無有機(jī)溶劑污染。因此，以TCA法除蛋白為宜。TCA法除蛋白后，多糖回收率為87.14%，蛋白去除率為79.37%，結(jié)果如圖3。

圖3 兩種除蛋白方法比較

3.3 色素的脫除 大孔樹脂AB-8脫色效果優(yōu)于其它兩種方法。因此，色素的脫除以大孔樹脂AB-8層析脫色為宜，此方法脫色后，多糖回收率為81.29%，色素脫出率為80.36%，結(jié)果如圖4。

圖4 3種脫色方法比較

3.4 柱層析分離純化

3.4.1 DEAE-52纖維素柱層析階段性梯度洗脫通過階段性梯度洗脫，確定洗脫的最高濃度，為線性洗脫中NaCl濃度的選擇提供依據(jù)。階段性梯度洗脫易出現(xiàn)假峰，需進(jìn)行線性梯度洗脫進(jìn)一步驗(yàn)證。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.6 mol/L時(shí)，多糖便可全部洗出，結(jié)果如圖5。因此，確定線性梯度洗脫的最高NaCl濃度為0.6 mol/L。

3.4.2 DEAE-52纖維素柱層析線性梯度洗脫 以0～0.6 mol/L NaCl進(jìn)行線性梯度洗脫，結(jié)果如圖6。經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析分離后有一個(gè)較大的主峰，合并10～55管主峰洗脫液，濃縮透析后進(jìn)行Sephadex G-200凝膠柱層析。

圖5 DEAE-52纖維素柱層析階段性梯度洗脫圖譜

圖6 DEAE-52纖維素柱層析線性梯度洗脫圖譜

3.4.3 Sephadex G-200凝膠柱層析 經(jīng)Sephadex G-200凝膠柱層析后只有一個(gè)主峰，合并10～30管主峰洗脫液，濃縮透析后，乙醇沉淀，水浴蒸干后得精多糖純品，結(jié)果如圖7。

圖7 Sephadex G-200凝膠柱層析圖譜

3.5 光譜分析

3.5.1 紫外光譜掃描 精多糖和粗多糖的紫外光譜掃描圖，結(jié)果如圖8。表明，粗多糖在260 nm和280 nm處均有吸收，精多糖經(jīng)除蛋白，透析，柱層析等操作后，在260 nm和280 nm處已無特殊吸收，樣品純度較高。

圖8a 精多糖液紫外光譜掃描

圖8b 粗多糖液紫外光譜掃描

3.5.2 紅外光譜分析 夾竹桃葉多糖在3 412 cm-1(O-H的伸縮振動(dòng))，2 930 cm-1(C-H的伸縮振動(dòng))，1 621 cm-1(糖環(huán)的伸縮振動(dòng))，1 380 cm-1(C-H的彎曲振動(dòng))，1 078 cm-1(C-O的彎曲振動(dòng))等多處出現(xiàn)多糖的特殊吸收峰。且在3 412 cm-1處有一較強(qiáng)且較寬吸收，表明在多糖中羥基形成氫鍵。900.4 cm-1處的吸收，表明該多糖為 β-糖苷型多糖，1 027cm-1處較強(qiáng)吸收和773 cm-1處的較弱吸收，表明該多糖以吡喃糖為主，呋喃糖較少，810 cm-1處和870 cm-1處無吸收峰，表明該多糖中不含或含有少量甘露糖，結(jié)果如圖9～10。

圖9 精多糖紅外光譜分析

圖10 粗多糖紅外光譜分析

4 討論

4.1 乙醇沉淀過程中與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的最終乙醇濃度相一致均為 80%［8-9，20］，不同的植物多糖醇沉?xí)r間略有差異，本文選取醇沉?xí)r間為8 h。

4.2 Sevag法和TCA法是多糖除蛋白的常用方法，應(yīng)用較為廣泛，兩種方法均有大量文獻(xiàn)報(bào)道［11-12，15，19］。Sevag 法作用溫和，但有機(jī)溶劑消耗較大，操作復(fù)雜。TCA法除蛋白操作簡單，效果明顯，但有文獻(xiàn)報(bào)道如不及時(shí)用堿中和易引起多糖結(jié)構(gòu)改變［18］。本文對(duì)用TCA法除蛋白后的多糖進(jìn)行紅外光譜分析，表明TCA法除蛋白效果明顯且不會(huì)對(duì)多糖造成結(jié)構(gòu)上的破壞，結(jié)果見圖9～10。

4.3 色素的脫除是多糖純化中重要的一步，本實(shí)驗(yàn)比較了3種不同的脫色方法，選取最佳方法為大孔樹脂AB-8柱層析脫色。

4.4 經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-200柱層析分離后只有一個(gè)主峰，表明該多糖為單一組分多糖。

4.5 紫外光譜掃描分析表明，夾竹桃葉多糖經(jīng)分離純化后的精多糖，在260 nm和280 nm處無特殊吸收，樣品中幾乎不含游離蛋白和核酸類物質(zhì)。紅外光譜結(jié)果表明，夾竹桃葉多糖以β-糖苷型吡喃糖為主。

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