李維峰， 翟永松， 杜守穎

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102)

槐米始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，其主要化學(xué)成分為含黃酮類化合物，蘆丁為槐米中的主要藥用化學(xué)成分。蘆丁及其衍生物具有廣泛的藥理活性［1］，臨床應(yīng)用于防止腦溢血、高血壓等心腦血管疾病。但其水溶性差。將難溶性藥物制成固體分散體，是增加藥物分散度、溶解度、溶出速率、提高藥物生物利用度的一種有效方法［2］。本實驗直接采用購置蘆丁，將蘆丁和多種載體制成其固體分散體，并采用紫外-分光光度法研究不同的載體及制備工藝對蘆丁在水中溶出速率的影響，找到最適合的載體、制備方法及工藝。

1 儀器與材料

UNICO UV-2000紫外-可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)，RC-8DS溶出度測試儀(天津市光學(xué)儀器廠)，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，CDR-4P差熱分析儀(上海天平儀器廠)。

蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100080-200306，含量 91.7%，供 UV法含量測定用);蘆丁，含量≥95%(湖南中辰科技有限公司，批號 20070628)。β-環(huán)糊精、聚乙烯吡咯烷酮PVPK30、羥丙甲纖維素HPMC(藥用級，湖州展望藥業(yè)化學(xué)有限公司);聚乙二醇-6000、琥珀酸(分析純，廣東汕頭市西隴化工廠);乳糖(MEGGLE公司提供);泊洛沙姆188(北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司，批號20060801)。

2 實驗方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取干燥至恒重的蘆丁對照品10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。分別精密量取上述溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL 置于 50 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以溶劑為空白，在360 nm處測定吸光度A，以吸光度A為縱坐標(biāo)，以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算回歸方程為:y=25.613x-0.001 2，r=0.999 9(線性范圍為0.008～0.036 mg/mL)。

2.2 固體分散體制備工藝的考察

2.2.1 溶出度的測定［3］采用2005年版中國藥典溶出度測定中的方法。每個膠囊樣品量約0.3 g，共6份。用智能溶出儀模擬人胃液pH環(huán)境。恒速100 r/min，水浴恒定(37±0.5)℃，溶出介質(zhì)為900 mL的0.1 mol/L鹽酸溶液。在上述溶出條件下，分別于2、4、6、9、15 min 時，定時取樣 5 mL，立即用0.8 μm的微孔濾膜過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液4 mL，用0.1 mol/L鹽酸溶液為空白，在360 nm處測定吸收度A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出累積溶出百分率。

2.2.2 冷凍時間考察 制備固體分散體方法很多，選擇最常用的3種方法。所采用的冷凍時間各異，多以24 h為準(zhǔn)。由此選擇載體(用PEG6000)、蘆丁與載體比例(1∶9)、3種常用的制備方法、加熱溫度80℃、-20℃冷凍，分別冷凍24、36、48 h。將制備固體分散體按要求裝膠囊，用累積溶出百分率作為指標(biāo)來考察冷凍時間。

按比例稱取蘆丁與載體共10 g，按下面方法制備固體分散體。

①溶劑法:將蘆丁與載體均勻溶于適量無水乙醇，磁力攪拌(100 r/min)3 min達到均勻，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)溶劑，至不再有液體滴落為止。②熔融法:將載體研細(xì)，用超級恒溫水浴(溫度80℃)加熱熔融后，磁力攪拌(100 r/min)3 min達到均勻，恒溫下加入蘆丁繼續(xù)攪拌15 min達到均勻。③溶劑-熔融法:將蘆丁溶于適量無水乙醇中，再將載體用超級恒溫水浴(溫度80℃)加熱熔融，磁力攪拌(100 r/min)3 min達到均勻，恒溫下將蘆丁溶液加入熔融載體中繼續(xù)攪拌，直至蒸干溶劑。上述3種方法均在-20℃下分別冷卻至規(guī)定時間，成品貯于真空干燥器中24 h，研細(xì)，過篩(80目)，備用。

2.2.3 固體分散體制作的載體、方法考察 分別用7種載體，按比例1∶9稱取蘆丁與載體共10 g，按3種方法分別制備固體分散體，冷凍36 h，并按前面方法，以累積溶出百分率為考察指標(biāo)。同時選出最優(yōu)載體及制備方案，為下一步正交試驗確定初步條件。

2.2.4 正交試驗 以無水乙醇為溶劑，載體PEG6000，冷凍時間36 h，采用溶劑熔融法，制備蘆丁-PEG6000固體分散體。選擇熔融時間(A)、藥物與載體比例(B)、加熱溫度(C)三個考察因素，每個因素設(shè)三個水平。按L9(34)正交試驗進行試驗，測定累積溶出百分率。以15 min累積溶出度(F15min)為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳制備工藝。因素水平見表1。

表1 因素水平

2.3 固體分散體的物相鑒別 本實驗采用差示掃描量熱法，對蘆丁、PEG6000、物理混合物、固體分散體分別進行掃描。測定條件:以空鋁坩堝為參比物，另一鋁坩鍋放入約10 mg的樣品，掃描速度2℃/min，掃描范圍20～400℃。

2.4 蘆丁固體分散體與蘆丁及蘆丁各種混合物累積溶出度比較 從溶出曲線上，可以看出各樣品間在不同時間溶出的差別，但無法給出各樣品的溶出有無相似。因而采用相似因子法，來進一步考察固體分散體、物理混合物的溶出情況。按1∶9的比例分別精密稱定蘆丁與淀粉、蘆丁與PEG6000(物理混合)，并裝膠囊，內(nèi)容物量不少于0.4 g。按2.2.1項下方法，在210 min內(nèi)，測定原料蘆丁、蘆丁與淀粉、蘆丁與PEG6000、固體分散體(均過80目篩)溶出度。

2.5 溶解度的測定 按2.2.2項下溶劑-熔融法制備蘆丁與載體比例為1 ∶0、1 ∶3、1 ∶6、1 ∶9、1∶12的固體分散體。精密稱定待測物約0.1 g置具塞三角瓶中，加20 mL蒸餾水溶解(保證有部分不溶)，恒溫(分別選擇25℃、50℃、75℃)，100 r/min磁力攪拌24 h，靜置15 min。得飽和溶液，用0.8 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1 mL，濾液揮干水后，加甲醇10 mL溶解，搖勻。在360 nm處測溶液吸光度A，代入回歸方程(y=25.613x-0.001 2)計算其中蘆丁在水中的溶解度。

3 結(jié)果與分析

3.1 冷凍時間考察 結(jié)果顯示，3種方法冷凍24 h制備樣品溶出最差，36 h與48 h溶出基本一致。因此可以確定，以后的固體分散體制備的冷凍時間均可確定36 h。

3.2 固體分散體制作的載體、方法考察 結(jié)果，采用溶劑法，琥珀酸效果最優(yōu)，F(xiàn)15min為80%;采用熔融法，PEG6000效果最優(yōu)，F(xiàn)15min為75%;采用溶劑熔融法，PEG6000效果最優(yōu)，F(xiàn)15min為90%。因此選擇PEG6000以溶劑熔融法制備固體分散體。

3.3 正交試驗 以蘆丁溶出度為考察指標(biāo)，進行方差分析，結(jié)果見表2、3。

表2 正交試驗方案與結(jié)果

結(jié)果表明，B因素有顯著性差異，最佳工藝為A3B3C3。A和C因素差異不顯著，考慮到溫度對藥物的穩(wěn)定性影響和成本問題，故將優(yōu)選工藝定為A1B3C1。鑒于此，進行驗證試驗確定工藝。

表3 正交試驗方差分析

3.4 驗證試驗 按A3B3C3和A1B3C1工藝制備固體分散體，各平行作3份。按上述溶出度測定方法和測試方法操作，結(jié)果見表 4，表明 A1B3C1與A3B3C3工藝無差異。

根據(jù)文獻，本實驗也采用聯(lián)合載體，發(fā)現(xiàn)水溶性載體與卵磷脂配合，溶出效果較好，但由于其效果與正交結(jié)果相差不多，而且考慮到卵磷脂價格的原因，故未采用。

表4 驗證試驗結(jié)果

3.5 差示掃描量熱分析法 由圖1可見，蘆丁有兩處吸熱峰，第一個吸熱峰在129～145℃，第二個為179℃。PEG6000有一處吸熱峰，在63.4℃，為其熔點。物理混合物可看到蘆丁的第一個吸熱峰和PEG6000的吸熱峰都存在，但因其中蘆丁的量較少，導(dǎo)致蘆丁的峰強度減小。固體分散體中無蘆丁的吸熱峰，只剩下PEG6000的吸熱峰。說明此固體分散體中蘆丁以非晶型存在，均勻分散在載體PEG6000中。

圖1 差示掃描量熱分析法圖譜

3.6 蘆丁固體分散體與蘆丁各種混合物累積溶出度比較 見表5。

采用相似因子(f2)法［4］比較各溶出曲線的相似性。f2的計算公式如下:

Xti——受試制劑于i點的平均累積溶出度

Xri——參比制劑于i點的平均累積溶出度

N為測試總點數(shù)

f2表示溶出曲線的累積溶出百分率相似性，當(dāng)50≤

f2≤100時表示兩條溶出曲線相似。見圖2。

圖2 不同物質(zhì)溶出百分率比較

以f2對4種樣品的溶出度進行評價，以確定蘆丁固體分散體與另3種制劑(原料蘆丁、蘆丁加淀粉、物理混合物)的溶出行為是否相似，結(jié)果見表6。

表6 不同情況下蘆丁累積溶出相似因子

經(jīng)計算得不同樣品的溶出曲線之間的f2值分別為9.343、19.290、32.606，表明固體分散體與原料蘆丁、蘆丁加淀粉、物理混合物的溶出曲線間都不具有相似性。

3.7 溶解度測定［5］不同分散體不同比例溶解度見表7，做溶解度對比例的線性回歸，見表8。

由直線斜率和截距可得出共沉淀常數(shù):K=斜率/S0(斜率-1)。

再根據(jù)K與T的關(guān)系式:logK=-ΔH0/2.303 RT+ΔS0/2.303R，進行線性回歸，y=1 257.8x-0.443 1，R=0.946 5求得 ΔH0和 ΔS0。

自由能可由公式ΔG0=-RTlnK0計算，見表9。

表7 固體分散體不同比例的溶解度

表8 不同溫度的溶解度對比例的回歸方程

表9 分散作用的熱力學(xué)函數(shù)值

由結(jié)果可見，ΔH0、ΔS0在任何溫度下均為負(fù)值，說明蘆丁固體分散體的形成為放熱過程，并且是一個熵減的從無序到有序的過程。這是一個焓控制過程，低溫更有利于它的發(fā)生，因此在制備過程中盡量采用較低的溫度(使載體熔融的最低溫度)。負(fù)的自由能，說明該過程為自發(fā)過程，只要條件成熟，此過程就可實現(xiàn)。

4 討論

固體分散技術(shù)系將難溶性藥物以分子、膠態(tài)、微晶或無定型狀態(tài)高度分散于水溶性、難溶性或腸溶性固體載體中，形成固體分散體的新型藥物制劑技術(shù)。從蘆丁固體分散體的溶出度的結(jié)果可以看出，蘆丁與各種載體制成固體分散體后溶出度均提高。其中PEG6000作為載體，蘆丁的溶出度提高更大。PEG是水溶性高分子無定形聚合物，易溶于水和多種有機溶媒。其為結(jié)晶性高聚物，熔點低，在熔融狀態(tài)下容易與分散很好的蘆丁再次分散，形成分子、膠體或超細(xì)狀態(tài)的高分散體。固體分散體中PEG使其成為無定形、高能態(tài)、高分散的狀態(tài)，固體分散體具有較大的表面積，隨著可溶性載體的快速溶解，藥物也迅速釋放。該方法能使藥物與載體均勻結(jié)合，有利于固體分散體的形成。

制作蘆丁固體分散體多采用鋼板為容器，因為鋼板具有較好的導(dǎo)熱效果，可以達到固體分散體制作過程中所要求的驟冷的效果，但是其制作過程較為復(fù)雜，要求經(jīng)過多次轉(zhuǎn)移，過程中損失較多。所以我們采用培養(yǎng)皿為固體分散體制作儀器，為了克服玻璃導(dǎo)熱不好的特點，將其放在平坦的冰面上，以達到驟冷的效果。

相似因子法能較好地評價各樣品間溶出曲線的相似性，在確定藥物溶出度差異方面可以發(fā)揮重要作用。

熱力學(xué)第二定律是自然界的普適定律，任何過程的發(fā)展、變化，皆離不開熱力學(xué)，而在熱力學(xué)眾多函數(shù)中，Gibbs函數(shù)無疑是其核心，通過固體分散體溶解度的測定，來解決Gibbs函數(shù)的數(shù)值，進而探討其形成機理，在藥物生產(chǎn)的各過程中均可應(yīng)用。

［1］宋曉凱.天然藥物化學(xué)［M］.北京:化工出版社，2004:74-92.

［2］陸 彬.藥物新劑型與新技術(shù)［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:12-14.

［3］中國藥典［S］.二部.2005:附錄73-74.

［4］歐陽德方.采用相似因子法評價不同因素對復(fù)方二甲雙胍格列吡嗪雙層緩釋片體外釋放的影響［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2006，23(1):1-5.

［5］張小莉，王東文.蘆丁-PEG6000固體分散體的制備及其溶解性能研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2000，16(6):306-308.