付艷麗， 高云濤， 李競春， 貝玉祥， 王 辰， 王明華

(云南民族大學化學與生物技術學院，云南昆明650031)

竹葉蘭(Arundina graminifoli(D.Don)Hochr)為蘭科(Orchidaceae)、竹葉蘭屬(Arundina)植物，又名黃竹參［1］，傣藥名紋尚海［2］，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種重要的傣藥，其藥用部位主要為根莖，具有清熱解毒、祛風除濕、散瘀止痛、消炎、利尿等作用［3-5］。

傳統(tǒng)中藥活性成分提取工藝的優(yōu)化有正交設計法［6］和均勻設計［7］法。星點設計(Central Composite Design，CCD)［8-12］是在析因設計的基礎上，由析因點及中心點而形成的可進行線性或非線性擬合的實驗設計方法，它具有試驗次數少、試驗精度高等特點，在藥學應用上成效顯著。響應面分析法(Response Surface Method，RSM)［13-16］是通過對響應面等值線的分析尋求最優(yōu)工藝參數，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間函數關系的一種統(tǒng)計方法，使用起來直觀、方便、效果較好。

本實驗以超聲提取技術［17-20］與丙醇-硫酸銨雙水相萃取［21-23］體系進行耦合［24］，在常溫條件下，從傣族雅解藥竹葉蘭中提取總黃酮物質，采用星點設計結合響應面分析法進行優(yōu)化，得到竹葉蘭總黃酮最佳提取工藝，為探討該法在民族特色藥提取工藝優(yōu)化方面提供了實驗依據。

1 實驗部分

1.1 材料與方法

1.1.1 實驗材料與試劑 竹葉蘭(購于西雙版納州傣醫(yī)醫(yī)院)，用前粉碎至80 mesh以下;蘆丁標準品(購于中國藥品生物制品檢定所，批號:10008);5%NaNO2溶液;10%Al(NO3)3溶液;4%NaOH溶液。所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.1.2 儀器 AS3120A超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);7200型紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司);旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 丙醇-硫酸銨雙水相體系的形成 準確配制一定濃度的硫酸銨水溶液，吸取一定體積于25 mL比色管，然后用已知濃度的正丙醇定容至刻度，確保溶液混合后分相，即得到25 mL丙醇-硫酸銨雙水相體系的混合液。

1.2.2 竹葉蘭總黃酮的提取和測定 準確稱取1.00 g樣品于100 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL丙醇-硫酸銨雙水相體系混合液，靜置1 h，超聲提取50 min后，抽濾，濾液轉入60 mL分液漏斗中，待完全分相后，取上層清液，以70%乙醇溶液定容至25 mL作為待測液?？傸S酮測定采用NaNO2-Al(NO3)3分光光度法，以蘆丁為標準，測定波長510 nm，回歸方程:A=12.546C+0.005 8，R2=0.999 8。

1.3 實驗設計

1.3.1 因子設計 選擇超聲時間、丙醇濃度、硫酸銨用量作為本次實驗的主要影響因子，設計響應面因素水平分布，如表1所示。

表1 因素水平設計Table 1 Experiment assignment of the levels and factors

1.3.2 星點設計方案 根據中心組合設計原理，以超聲時間、丙醇濃度、硫酸銨用量三個因素為自變量X1、X2、X3，總黃酮得率為響應值，設計了共20個實驗點的響應面分析實驗，其中14個析因點，6個零點，實驗方案見表2。

表2 實驗設計與結果Table 2 Experiment design and the results

2 結果與討論

2.1 回歸模型 以竹葉蘭總黃酮的提取率為響應值，對各因素進行回歸擬合，得到響應值Y和各因子之間的二次回歸方程(R2=0.895 1):

該方程P＜0.000 1，所以該模型是顯著的，可用來預測超聲耦合丙醇-硫酸銨雙水相體系提取竹葉蘭中總黃酮物質的最佳提取工藝。

2.2 方差分析 表3中統(tǒng)計分析數據給出了線性項、二次項、以及交互項對竹葉蘭總黃酮提取得率的影響，其中線性項，硫酸銨用量(P＜0.000 1)和超聲時間(P＜0.000 1)，所有二次項以及交互項中，丙醇濃度和硫酸銨用量的交互作用(P=0.000 2)、丙醇濃度和超聲時間的交互作用(P=0.004 4)對模型具有高度顯著性。硫酸銨用量和超聲時間的交互作用顯著(P＜0.05)。線性項中，丙醇濃度影響不顯著(P=0.354 1)。

2.3 響應面分析 保持三個變量中的一個不變，得到超聲時間、丙醇濃度、硫酸銨用量之間其他兩個因素之間的三維響應面曲線，見下圖1a～c。

表3 響應面二次模型的方差分析結果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

圖1a～c超聲時間(X1)、硫酸銨用量(X2)和丙醇濃度(X3)對總黃酮得率(%)影響的3D響應面曲線Fig.1 a～c Response surface(3D)showing the effect of ultrasonic time(X1)，ammonium sulfate(X2)and propanol concentration(X3)on the response value of general flavonoids yield

圖a和b顯示，總黃酮得率隨著超聲時間的延長而提高，50 min左右趨于穩(wěn)定值;圖a和c顯示，硫酸銨影響并不顯著，大約在硫酸銨濃度22.5%;圖b和圖c顯示，丙醇濃度對黃酮得率的影響最顯著，黃酮得率隨著丙醇濃度的增大明顯上升，大約55%趨于穩(wěn)定。

2.4 愿望函數優(yōu)化及實驗驗證 Design Expert軟件為響應面分析提供了最佳條件化優(yōu)化模塊，在進行數字化優(yōu)化時，超聲時間為定值50 min，硫酸銨用量在10% ～35%范圍內，丙醇濃度選擇在30% ～70%范圍內，總黃酮得率選擇最大值。見圖2。

由軟件分析得到最佳提取工藝為:超聲時間50 min，硫酸銨用量20.54%，丙醇濃度54.81%，黃酮得率預測值為3.65%，考慮實際情況，將各因素條件取整，從而確定竹葉蘭總黃酮的最佳提取工藝:硫酸銨用量20%，丙醇濃度55%，超聲時間50 min。

圖2 愿望函數優(yōu)化設計Fig.2 Desirability ramp for numerical optimization

在此條件下進行實驗驗證，結果黃酮平均得率為3.53%(n=3)，與預測值接近，說明了愿望函數優(yōu)化所得到理論最佳工藝的可行性和有效性。

2.5 不同提取方法的比較 將本法與其它3種提取方法進行比較研究，料液比均為1∶25，各方法的提取條件分別為，乙醇-水回流法:乙醇濃度70%，回流時間1 h，提取溫度80°C;乙醇-水超聲提取法:乙醇體積分數70%，常溫下超聲50 min;雙水相提取法:丙醇濃度55%，硫酸銨用量20%，靜置過夜;超聲耦合雙水相提取法:丙醇濃度55%，硫酸銨用量20%，常溫下超聲50 min。結果如圖3所示，結果表明，超聲耦合丙醇-硫酸銨雙水相體系用于提取竹葉蘭中總黃酮物質，不僅用時短，常溫下可進行，避免了某些活性成分因高溫分解而損失，而且得率也高于其它方法，證明了超聲耦合雙水相體系的優(yōu)越性，具有一定的實用價值。

圖3 不同提取方法的比較Fig.3 Comparison of different extraction methods

3 結論

運用Design Expert軟件進行星點設計-響應面分析，成功設計模型，得出了丙醇濃度和超聲時間是影響竹葉蘭中總黃酮物質得率的主要因素，丙醇濃度和硫酸銨用量之間存在著較強的交互作用。同時也獲得了超聲耦合丙醇-硫酸銨雙水相體系提取竹葉蘭總黃酮物質的最佳提取工藝:丙醇濃度為55%，超聲時間為50 min，硫酸銨用量20%，在此條件下竹葉蘭總黃酮得率為3.53%，與預測值基本相符，說明了用響應面分析法來設計最佳提取工藝的可靠性。

丙醇-硫酸銨雙水相體系中，黃酮類物質應分配于上相有機相，而其它水溶性成分則分配于鹽水下相中，從而在提取的同時也實現了黃酮類物質與某些無效成分如糖類等的分離，有效提高了產物的純度。另外，在提取過程中，黃酮類產物轉移至丙醇上相，可改變提取過程中的化學平衡，有利于更多黃酮類物質的溶出。因此，實驗研究表明，超聲波與丙醇-硫酸銨雙水相體系可方便實現集成，并能縮短提取時間、提高效率，降低提取溫度，避免了某些活性成分因高溫分解而損失，獲得了高純度和活性的竹葉蘭黃酮提取物，在傣藥活性成分的提取分離方面展現了良好的應用前景。

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