張長城， 賈亮亮， 李守超， 徐媛青， 李玉洲， 曾 曉， 袁 丁， 何毓敏， 王洪武

(三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002)

環(huán)磷酰胺是一種臨床常見的抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于各種血液系統(tǒng)和實(shí)體腫瘤的治療，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的藥理作用。臨床研究顯示，環(huán)磷酰胺具有明顯生殖毒性，可導(dǎo)致男性生精障礙和子代遺傳性缺陷或畸形［1］，因此，尋找有效的防護(hù)措施從而拮抗環(huán)磷酰胺的生殖毒性已成為研究的重點(diǎn)之一。淫羊藿總黃酮作為中藥淫羊藿的主要活性部位，具有促進(jìn)性腺發(fā)育、調(diào)節(jié)體內(nèi)性激素水平和生殖功能的作用［2，3］，但淫羊藿總黃酮是否具有拮抗環(huán)磷酰胺所致生精障礙的藥理作用尚未明確。

1 材料

1.1 藥品與試劑 淫羊藿總黃酮，成都仁誠生物科技有限公司提供，經(jīng)HPLC測定含量為80%，臨用前用1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液超聲溶解，配成相應(yīng)濃度的溶液;注射用環(huán)磷酰胺(批號(hào):08121021)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。Bouins液:苦味酸飽和水溶液750 mL，甲醛250 mL，冰醋酸50 mL。精子營養(yǎng)液:BWW(NaCl 0.554 g/L、KCl 0.035 6 g/L、CaCl20.025 g/L、KH2PO40.016 2 g/L、MgSO4/7H2O 0.029 4 g/L、NaHCO30.210 g/L、Na-Pyr 0.003 g/L、Nalac 0.370 g/L、Glucose 0.100 g/L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的酚紅1.0 mL、青霉素10 000 u、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的BSA)。其余藥品均為分析純。

1.2 動(dòng)物 BalB/c種小鼠，SPF級，8～9周齡，22～25 g，♂性，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2008-0005。

1.3 儀器 SQIAS-2000彩色精液質(zhì)量圖文分析儀，武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司;DMR型多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)，德國Leica公司;H-7500型透射式電子顯微鏡，德國Leica公司;ULTRACUT R型超薄切片機(jī)，奧地利萊卡公司;JA2003型電子分析天平，上海天平儀器廠。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備 40只BalB/c♂性小鼠，隨機(jī)分為5組，依次為:空白組、模型組、淫羊藿總黃酮低劑量組(黃低組，200 mg/kg)、淫羊藿總黃酮中劑量組(黃中組，400 mg/kg)及淫羊藿總黃酮高劑量組(黃高組，800 mg/kg)。除空白組外，其余小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，連續(xù)注射7 d，空白組腹腔注射等量生理鹽水?？瞻捉M和模型組每天灌服1%羧甲基纖維素鈉0.2 mL，淫羊藿總黃酮低、中、高劑量組分別給予淫羊藿總黃酮200、400、800 mg/kg，各組小鼠連續(xù)給藥35 d。

2.2 小鼠生殖器官重量的測定 末次給藥24 h后稱重，處死小鼠，取睪丸和附睪并稱濕重。

2.3 小鼠精子密度及精子活率的測定 將盛有6 mL精子營養(yǎng)液［4］的試管置于恒溫水浴箱預(yù)熱至37℃，取單側(cè)附睪，去除脂肪，剪碎放入試管中，搖勻，37℃保溫10～15 min，使精子充分游離，接著取1滴滴入牛鮑氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)算每毫升精子數(shù)。用微量移液器吸取10 μL精子懸液，利用 SQIAS-2000彩色精液質(zhì)量圖文分析儀進(jìn)行精子活率測定。

2.4 小鼠睪丸各倍體生精細(xì)胞比例的影響測定取單側(cè)睪丸，去除包膜，剪碎，置于3 mL pH7.4的PBS試管中，于旋渦震蕩混合器上混合3 min，組織細(xì)胞液用200目尼龍網(wǎng)過濾于試管內(nèi)，1 500 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀懸浮后加3 mL PBS，混勻1 min，同樣條件，重復(fù)洗滌2次，制成單細(xì)胞懸液。PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至106～107/mL，4℃、70%乙醇固定2 h后，低速短時(shí)離心去除固定液，PBS洗兩遍，加40 μg/mL 的 RNA 酶400 μL，于37 ℃水浴30 min，加入100 μL PI染液混勻，4℃避光染色30 min，即可上機(jī)進(jìn)行檢測，計(jì)算出不同倍體細(xì)胞的百分比。

2.5 小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察［5］取單側(cè)睪丸，石蠟切片，HE染色，光鏡觀察睪丸組織內(nèi)精原細(xì)胞與各級生精細(xì)胞的分布情況。環(huán)氧樹脂包埋，作超微切片，電鏡觀察睪丸組織內(nèi)曲細(xì)精管及各級生精細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件處理，實(shí)驗(yàn)各個(gè)指標(biāo)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(±s)，各組均數(shù)之間比較進(jìn)行one-way ANOVA檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿總黃酮對模型小鼠生殖器官重量的影響 模型組小鼠睪丸重量、附睪重量及睪丸指數(shù)顯著低于空白組，體重及附睪指數(shù)與空白組比較無顯著性降低。淫羊藿總黃酮各劑量均對可以顯著增加生精障礙小鼠體重。淫羊藿總黃酮中、高劑量可以顯著增加生精障礙小鼠睪丸重量，淫羊藿總黃酮高劑量對附睪重量有顯著的增加作用。結(jié)果見表1。

3.2 淫羊藿總黃酮對模型小鼠精子密度及精子活率的影響 模型組小鼠精子密度、精子活率顯著低于空白對照組。淫羊藿總黃酮各劑量均可顯著提升生精障礙小鼠的精子密度和精子活率。結(jié)果見表2。

3.3 淫羊藿總黃酮對模型小鼠睪丸各級生精細(xì)胞比例的影響 模型組小鼠1C和4C細(xì)胞百分比顯著下降，淫羊藿總黃酮低、中、高劑量均可顯著增加提高生精障礙小鼠睪丸內(nèi)1C和4C細(xì)胞的百分比，而2C細(xì)胞比例相對下降。結(jié)果見表3。

表1 淫羊藿總黃酮對模型小鼠生殖器官重量的影響(±s，n=8)Table 1 The effect of total flavones of Epimedium on generative organs in model mice(±s，n=8)

表1 淫羊藿總黃酮對模型小鼠生殖器官重量的影響(±s，n=8)Table 1 The effect of total flavones of Epimedium on generative organs in model mice(±s，n=8)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。Note:*P＜0.05，**P＜0.01 compared with model group

組別 體重/g 睪丸重/g 睪丸指數(shù)/(mg/g) 附睪重/g 附睪指數(shù)/(mg/g)空白組 25.20±1.13 0.100±0.005 4.00±0.025 0.032±0.001 1.25±0.151模型組 24.50±1.40 0.076±0.013 3.09±0.522 0.027±0.003 1.10±0.169黃低組 26.90±2.03* 0.090±0.008 3.34±0.284 0.030±0.002 1.12±0.068黃中組 27.73±1.45* 0.092±0.009* 3.32±0.315 0.030±0.004 1.12±0.131黃高組 28.39±1.81** 0.094±0.012* 3.31±0.477 0.032±0.003**1.13±0.134

表2 淫羊藿總黃酮對模型小鼠精子密度及精子活率的影響(±s，n=8)Table 2 The effect of total flavones of Epimedium on sperm count and motility rate in model mice(±s，n=8)

表2 淫羊藿總黃酮對模型小鼠精子密度及精子活率的影響(±s，n=8)Table 2 The effect of total flavones of Epimedium on sperm count and motility rate in model mice(±s，n=8)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。Note:*P＜0.05，**P＜0.01 compared with model group。

/%空白組組別 精子密度/(106/mL) 精子活率91.25±13.08 67.00±7.78模型組 28.31±5.64 37.13±11.51黃低組 51.87±18.50* 56.07±9.60**黃中組 58.87±15.48* 58.33±12.76**黃高組 68.00±20.95** 60.12±8.57**

表3 淫羊藿總黃酮對模型小鼠睪丸各級生精細(xì)胞比例的影響(±s，n=8)Table 3 The effect of total flavones of Epimedium on the percentage of spermatogenic cells in model mice(±s，n=8)

表3 淫羊藿總黃酮對模型小鼠睪丸各級生精細(xì)胞比例的影響(±s，n=8)Table 3 The effect of total flavones of Epimedium on the percentage of spermatogenic cells in model mice(±s，n=8)

注:與模型組比較*P ＜0.05，**P＜0.01。Note:*P＜0.05，**P＜0.01 compared with model group。

1C/% 2C/% 4C/%空白組組別52.45±3.17 15.78±1.53 25.46±1.79模型組 29.82±1.72 25.08±1.51 16.62±2.07黃低組 37.28±2.82** 18.36±2.80* 23.11±1.96**黃中組 38.25±2.19** 16.60±1.37** 24.78±1.60**黃高組 39.43±4.11** 15.08±1.87** 26.67±3.80**

3.4 淫羊藿總黃酮對模型小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響 光鏡可見，模型組小鼠睪丸內(nèi)生精小管多退化、萎縮，管壁生精上皮變薄，生精細(xì)胞層數(shù)減少，排列紊亂，精子細(xì)胞較少，腔內(nèi)精子少見，睪丸生精小管間隙明顯增大。淫羊藿總黃酮組小鼠睪丸內(nèi)大部分生精小管的各級生精上皮細(xì)胞層次較明顯，排列較規(guī)則，管腔內(nèi)可見較多成熟精子生成，基本達(dá)到正常的睪丸組織形態(tài)。見圖1。

圖1 淫羊藿總黃酮對模型小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 The effect of total flavones of Epimedium on testis histomorphology in model mice

3.5 淫羊藿總黃酮對模型小鼠睪丸組織超微結(jié)構(gòu)的影響 電鏡下可見，正常小鼠睪丸初級精母細(xì)胞豐富，可見活躍細(xì)胞分裂相，生精上皮層次排列規(guī)則(圖2-a，→為初級精母細(xì)胞);模型組小鼠睪丸初級精母細(xì)胞明顯缺失，無明顯細(xì)胞分裂相，生精上皮細(xì)胞層變薄，多見形態(tài)異常的精子細(xì)胞(圖2-b，←為異常精子細(xì)胞);治療組睪丸超微結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)，淫羊藿總黃酮低劑量組可見各級生精細(xì)胞(圖2-c，→為初級精母細(xì)胞);淫羊藿總黃酮高劑量組出現(xiàn)較多精原細(xì)胞、精母細(xì)胞，精子數(shù)量變多，生精上皮厚度增加，層次排列較好(圖2-d，←為初級精母細(xì)胞)，細(xì)胞形態(tài)趨于正常。見圖2。

4 討論

環(huán)磷酰胺是一種臨床常見的抗腫瘤藥物，其機(jī)制主要是通過對DNA的烷化作用而干擾細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)功能。生殖毒性作為環(huán)磷酰胺的主要副作用之一，目前越來越引起人們的關(guān)注。臨床研究表明，環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的生殖毒性可致無精子癥或少精子癥，導(dǎo)致不育或子代遺傳性缺陷或畸形［6］。淫羊藿在治療男性不育方面具有較好的療效，本實(shí)驗(yàn)通過環(huán)磷酰胺造成小鼠生精障礙模型，在此基礎(chǔ)上探討了淫羊藿總黃酮對環(huán)磷酰胺所致生精障礙的保護(hù)作用。

圖2 淫羊藿總黃酮對模型小鼠睪丸組織超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 The effect of total flavones of Epimedium on testis ultrastructure in model mice

睪丸是精子的生成場所，附睪對精子的成熟起了重要的作用;精子數(shù)量及活率是評價(jià)精液質(zhì)量的重要指標(biāo)，是影響受孕的主要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠睪丸、附睪重量以及精子密度、活率與空白組和治療組比較，均有顯著性差異，表明淫羊藿總黃酮對受損睪丸及附睪的修復(fù)以及精子的形成具有顯著的促進(jìn)作用，但治療組小鼠睪丸指數(shù)及附睪指數(shù)與模型組比較無顯著性差異，這可能與淫羊藿總黃酮顯著增加小鼠體重有關(guān)。睪丸的組織學(xué)觀察顯示，淫羊藿總黃酮治療后的模型小鼠睪丸生精小管生精上皮層次明顯增多，細(xì)胞層次分明，各期生精細(xì)胞排列較整齊、緊密、有序，管腔可見較多的精子;電鏡觀察睪丸組織的超微結(jié)構(gòu)顯示，淫羊藿總黃酮治療后模型小鼠睪丸內(nèi)生精上皮厚度增加，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞數(shù)量增多，精子數(shù)亦增多，細(xì)胞形態(tài)趨于正常水平，提示淫羊藿總黃酮在改善和恢復(fù)生殖細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)方面具有較好的作用。

睪丸中生精細(xì)胞包括1C細(xì)胞(精子細(xì)胞和精子)、2C細(xì)胞(精原細(xì)胞、次級精母細(xì)胞等)、4C細(xì)胞(初級精母細(xì)胞和處于 G2/M期的精原細(xì)胞)［7］。流式細(xì)胞術(shù)對睪丸各級生精細(xì)胞的分析顯示，淫羊藿總黃酮可以顯著性調(diào)節(jié)生精障礙小鼠各級生精細(xì)胞的比例，提高1C和4C細(xì)胞比例，提示淫羊藿總黃酮在生精障礙小鼠模型中，可能具有促進(jìn)精原細(xì)胞分裂并向初級精母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)次級精母細(xì)胞向精子細(xì)胞和精子轉(zhuǎn)化的作用。本實(shí)驗(yàn)初步探討了淫羊藿總黃酮對環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙的保護(hù)作用，為淫羊藿總黃酮在臨床上進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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