虞燕霞， 顧振綸， 殷江臨， 周文軒， 郭次儀， 梁中琴1，*

(1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)系，江蘇蘇州215123;2.蘇州中藥研究所，江蘇蘇州215007;3.蘇州市立醫(yī)院藥劑科，江蘇蘇州215002)

原發(fā)性肝癌系全球發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一。尋找毒副作用小、對(duì)肝癌細(xì)胞選擇性高、作用強(qiáng)的藥物是研究抗肝癌藥物的一個(gè)關(guān)鍵。

熊果酸(ursolic acid，UA)，又名烏索酸，烏蘇酸，屬α-香樹脂醇(α-amyrin)型五環(huán)三萜類化合物，以自由酸或三萜皂苷的形式廣泛存在于植物中。許多含有UA的植物在民間被用于抗炎、肝臟保護(hù)、鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜和滋補(bǔ)等多個(gè)方面，其中多個(gè)治療作用已經(jīng)被現(xiàn)代的科學(xué)方法研究證實(shí)。近年來，UA對(duì)腫瘤的抑制和殺傷效應(yīng)已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，UA對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，同時(shí)它還具有一定的肝臟保護(hù)作用。

肝癌細(xì)胞株SMMC-7721系來源于我國(guó)肝癌病人的腫瘤細(xì)胞株。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)UA對(duì)肝癌的作用機(jī)制研究甚少，特別是UA對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的作用還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討UA對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 熊果酸(UA)，由香港保健協(xié)會(huì)上海楊楊百草堂提供，純度99%。以10 mmol/L溶于DMSO中，-20℃保存?zhèn)溆?。MTT，AMRESO產(chǎn)品。PI(碘化丙錠)，Sigma公司;瑞氏-吉姆薩染液，南京建成生物工程研究所;細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所。Trizol Reagent，Invitrogen公司;Rneasy Mini Kit，Qiagen公司;引物由上海博彩生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)體系 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。SMMC-7721細(xì)胞用含10%滅活FBS(杭州四季青生物工程材料研究所)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco產(chǎn)品)于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔3 d傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 采用常規(guī)MTT法檢測(cè)UA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，接種于 96 孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。次日給予UA，終濃度分別為10、20、30、40、50、60 μmol/L，對(duì)照組加0.6%DMSO，同時(shí)設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的孔為空白對(duì)照。每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h。終止培養(yǎng)前4 h加入MTT(5 mg/mL，PBS配制，過濾除菌)，10 μL/孔，培養(yǎng)結(jié)束后，吸凈上清，每孔加入100 μLDMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。于酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm時(shí)的吸光度A值。用藥物濃度抑制軟件(Logit法)計(jì)算IC50。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)板中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。次日給予 UA 濃度分別為 30、40、50 μmol/L，對(duì)照組加0.5%DMSO，處理24 h后加入瑞氏-吉姆薩試劑染色10 min，用水沖去染液，晾干，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。細(xì)胞用相同方法處理后，用Hoechst 33258染色液染色10 min，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的變化。

1.5 流式細(xì)胞分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。次日給予UA，濃度分別為30，40，50 μmol/L，對(duì)照組加 0.5%DMSO，設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞，PBS洗2次。加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃，1 h。離心棄去固定液，PBS洗2次，加入100 μg/mL Rnase 37℃水浴30 min。PBS洗2次，PI 50 μg/mL染色避光4℃，30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 半定量RT-PCR檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞分為6組，一組只使用DMSO處理，其余五組使用 40 μmol/L UA 分別處理 3、6、12、24、48 h后收集細(xì)胞，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA。測(cè)定總 RNA濃度及純度。制備 cDNA，在Taq酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為94℃4 min，94 ℃ 30 s，退火溫度(Tm)30 s或45 s，72 ℃ 1 min，30～38個(gè)循環(huán)不等，最后均72℃延伸 8 min，引物、Tm及cycle詳見(表1)。將PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳，80 V電泳1 h，結(jié)果用凝膠成像儀(上海天能公司)掃描圖像。實(shí)驗(yàn)平行3份進(jìn)行，凝膠掃描圖像采用軟件分析，以GADPH條帶為內(nèi)參，數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析。

表1 PCR擴(kuò)增所使用的引物Table 1 Premier used for PCR amplification

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度的UA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞存活率影響的測(cè)定:見表2。UA 10 μmol/L 和 20 μmol/L 組濃度較低，對(duì)SMMC-7721細(xì)胞未見明顯的抑制作用，因此無顯著的時(shí)效性。UA從30 μmol/L作用24 h開始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著UA濃度的增加，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率逐漸降低，細(xì)胞增殖抑制作用明顯增強(qiáng)。UA作用24、48、72 h的 IC50分別為:45.72、23.22、21.76 μmol/L。

表2 熊果酸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞存活率的影響(±s，n=6)Table 2 Reduced viability of SMMC-7721cells after UA treatment(±s，n=6)

表2 熊果酸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞存活率的影響(±s，n=6)Table 2 Reduced viability of SMMC-7721cells after UA treatment(±s，n=6)

與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P＜0.001。

24 h 48 h 72 h control 0.807±0.033 1.152±0.022 1.422±0.238組別 OD值UA(μmol/L)10 0.767±0.031 1.038±0.040 1.215±0.172 20 0.820±0.021 1.032±0.033 1.385±0.167 30 0.699±0.034**0.523±0.038***0.440±0.038***40 0.373±0.071***0.145±0.034***0.090±0.015***50 0.162±0.033***0.022±0.024***0.008±0.012***60 0.097±0.003***0.012±0.010***0.000±0.000***

2.2 UA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響通過Wright-Giemasa染色，使用倒置顯微鏡觀察，正常對(duì)照組的細(xì)胞核染成紫色，胞漿染成粉紅色，色澤均一。隨著給藥濃度的增加細(xì)胞形態(tài)變化明顯，細(xì)胞膜皺褶卷曲，出泡以及芽生形成膜包裹的凋亡小體。使用Hoechst33258染色，在熒光顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組細(xì)胞核呈彌散，微弱，均勻的熒光;30 μmol/L組的細(xì)胞核內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光;40、50 μmol/L組明顯可見細(xì)胞核內(nèi)DNA的熒光碎片，可以認(rèn)為這就是凋亡細(xì)胞。

2.3 UA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的影響SMMC-7721 細(xì)胞經(jīng)過 30、40、50 μmol/L 3 個(gè)濃度組藥物處理24、48、72 h后，用藥組的凋亡細(xì)胞百分率明顯高于正常對(duì)照組，且呈一定的濃度和時(shí)間依賴性(圖1)。

圖1 熊果酸對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的影響(±s，n=3)Fig.1 Apoptosis rate of SMMC-7721 cells induced by UA(±s，n=3)

2.4 UA作用SMMC-7721細(xì)胞后凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的變化 各組PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，GADPH均有穩(wěn)定的表達(dá)，因而可作為參照。SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)過UA 40 μmol/L處理后，與對(duì)照組相比較:p53的mRNA在UA作用6 h和12 h表達(dá)增加，其他時(shí)間點(diǎn)表達(dá)較弱(圖2-1);Fas的mRNA隨UA作用時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)上調(diào)(圖2-2)。

圖2-1 熊果酸作用于SMMC-7721細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)p53基因表達(dá)的影響Fig.2-1 p53 gene mRNA expression of control and treated SMMC-7721 cells with UA at different time point

圖2-2 熊果酸作用于SMMC-7721細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)Fas基因表達(dá)的影響Fig.2-2 Fas gene mRNA expression of control and treated SMMC-7721 cells with UA at different time point

3 討論

已有研究表明UA能顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2的活性［1］。本實(shí)驗(yàn)用 MTT法檢測(cè) UA對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制作用，結(jié)果顯示UA在30 μmol/L濃度作用24 h就能產(chǎn)生明顯的抑制作用，且隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用也相應(yīng)加強(qiáng)。為了了解UA對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，本實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞儀的檢測(cè)技術(shù)證實(shí)了UA可以誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。

為了進(jìn)一步了解UA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的凋亡機(jī)制，我們使用了半定量PCR技術(shù)檢測(cè)了與凋亡相關(guān)的基因p53和Fas的表達(dá)。結(jié)果顯示UA能使這兩個(gè)基因表達(dá)增加。Manu KA等人的研究發(fā)現(xiàn)UA能誘導(dǎo)黑色素瘤B16F-10細(xì)胞的凋亡，同時(shí)還能誘導(dǎo)細(xì)胞中p53的表達(dá)［2］。p53基因是一個(gè)腫瘤抑制基因，它對(duì)于維護(hù)細(xì)胞的正常功能，監(jiān)控DNA損傷、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用［3］。作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，p53可以通過轉(zhuǎn)錄活化下游的靶基因，參與了多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)［4］。實(shí)驗(yàn)中p53基因在給藥6 h和12 h時(shí)表達(dá)增強(qiáng)較為顯著，而24 h和48 h表達(dá)不明顯，這可能是由于p53作為一個(gè)上游基因在被激活后引發(fā)了一系列下游基因的變化，同時(shí)隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)還有其他許多機(jī)制(如影響細(xì)胞周期等)參與了對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，使p53表達(dá)增加不顯著，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在SMMC-7721細(xì)胞中UA不僅能激活p53基因，同時(shí)也激活了p53的下游基因Fas。Fas的表達(dá)增加能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［5］。Fas/FasL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制是人體細(xì)胞自身新陳代謝進(jìn)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。Fas(Apo-1)是廣泛分布于多種細(xì)胞表面的一種跨膜糖蛋白，它與FasL結(jié)合后，通過 FADD的介導(dǎo)將凋亡信號(hào)傳遞給Caspase-8，激活Caspase-8產(chǎn)生一種連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶超家族中的其它成員相繼被激活。這些蛋白酶被激活后，將水解各自的底物，產(chǎn)生各種死亡效應(yīng)分子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在人類惡性腫瘤的發(fā)展過程中，常伴有腫瘤細(xì)胞表面Fas表達(dá)缺失或功能喪失。故誘導(dǎo)或增強(qiáng)Fas的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，UA作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞可以顯著抑制細(xì)胞增殖，其主要作用機(jī)制為誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞的凋亡?？赡艿姆肿訖C(jī)制是UA通過上調(diào)p53基因，從而引起了下游基因Fas上調(diào)。在這些上下游基因的聯(lián)合作用下細(xì)胞發(fā)生了凋亡。UA作為一種低毒、廉價(jià)的天然植物成分，在癌癥的預(yù)防和治療中有著廣闊的前景。本研究為UA在肝癌的預(yù)防和治療中提供了更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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