于柏艷， 孫 抒， 楊萬山， 李香丹

(延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林延吉133000)

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc)是多年生灌木狀草本，虎杖作為活血化瘀藥，在臨床上已被廣泛應(yīng)用;研究表明，虎杖在抗腫瘤方面可能扮演著重要角色。本實驗以人肺癌A549細(xì)胞株為研究對象，進(jìn)一步闡明虎杖的抗腫瘤作用及其作用機制，為天然藥物虎杖的開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物及試劑 新生小牛血清:華美生物工程公司產(chǎn)品;胰蛋白酶(Tripsin):華美生物工程公司產(chǎn)品;噻唑藍(lán)﹙MTT﹚:美國 Sigma公司產(chǎn)品;Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9、bcl-2、Ki-67、p21ras單克隆抗體及S-P通用試劑盒:美國Neo Markers公司產(chǎn)品，購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒:德國羅氏公司產(chǎn)品［含末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)，含有核苷酸混合液的反應(yīng)液及堿性磷酸酶轉(zhuǎn)化劑(Converter-AP);RNA酶A(RnaseA):美國Sigma公司產(chǎn)品;虎杖提取物:延邊大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室分離提供。

1.2 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱:USA產(chǎn)品;酶聯(lián)免疫檢測儀:美國RT-2100C型;倒置顯微鏡:日本OLYMPUS產(chǎn)品;FACS-Calibur型流式細(xì)胞儀:美國 Becton Dikinson公司產(chǎn)品。

1.3 實驗細(xì)胞 人肺癌A549細(xì)胞株購于南京凱基生物公司，由本科室體外傳代培養(yǎng)。

2 方法

2.1 虎杖提取物實驗分組及配制 (1)虎杖樣品購自于延吉市健康路大藥房，由延邊大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室劉永鎮(zhèn)教授鑒定為蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc)。稱取虎杖(根及根莖)5 kg粉末備用，用95%乙醇回流提取3次，減壓濃縮提取液，將濃縮后的浸膏用水分散后乙醚萃取，乙醚萃取液用5%NaHCO3溶液進(jìn)行萃取，所得水層酸化至pH=2，放置，抽濾，水洗沉淀至中性，干燥。得到NaHCO3沉淀物18.58 g，用于本次試驗。初步化學(xué)成分分析實驗顯示，虎杖沉淀物中含有蒽醌類化合物，甾體和黃葵內(nèi)酯等成分，其中蒽醌類化合物約占80%以上，虎杖中主要蒽醌類化合物是大黃素甲醚和大黃素。

(2)藥物分組:虎杖NaHCO3提取物采用20、40、80、160 μg/mL 4種濃度。

(3)藥物所需濃度配制:提取物用0.5%羧甲基纖維素納，生理鹽水和少量的Tween+80在藥液中的最高體積分?jǐn)?shù)低于1×10-4。

2.2 TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡 按說明書進(jìn)行操作。實驗結(jié)果判斷:TUNEL染色中細(xì)胞凋亡陽性物質(zhì)呈棕褐色位于細(xì)胞核內(nèi)，部分細(xì)胞漿也可因核DNA碎片的逸出呈陽性著色。每張爬片在400×高倍鏡下觀察5個視野，每個視野下分別計數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)并計算凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，AI)，求其平均值。AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。每個指標(biāo)做3次，每次TUNEL染色中以已知陽性物質(zhì)的肺癌組織切片為陽性對照，以不含TdT的TdT buffer代替TUNEL反應(yīng)混合液作陰性對照。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測 流式細(xì)胞術(shù)樣品制備:取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化，置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待貼壁后再加入虎杖提取物，使其終濃度為40 μg/mL，對照組加入等體積的生理鹽水。將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24 h，48 h后收集細(xì)胞，按以下步驟進(jìn)行:① 冷PBS(pH:7.2～7.4)洗滌2次，1 000 r/min離心，5 min;②在細(xì)胞沉淀中加入1 mL冷PBS(pH:7.2～7.4)制備成細(xì)胞懸液;③加入3 mL預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃保存過夜;④將單細(xì)胞懸液離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清;⑤冷PBS(pH:7.2～7.4)1 mL洗滌2次，1 000 r/min離心，5 min;⑥ 調(diào)整細(xì)胞數(shù)使其在1×106個/mL;⑦ 加入200 μL NaseA 37℃水浴30 min;⑧ 再加碘化丙錠(PI)染色液800 μL混勻，4℃避光30 min;⑨ 上機進(jìn)行流式細(xì)胞儀測定，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，檢測凋亡率，分析細(xì)胞周期分布情況。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 (1)細(xì)胞爬片標(biāo)本制作如上述，4℃冰乙醇固定30 min，操作方法按S-P試劑盒說明書進(jìn)行。(2)染色結(jié)果判斷:觀察以細(xì)胞內(nèi)見清晰棕色顆粒為陽性細(xì)胞。Bcl-2和p21ras以細(xì)胞漿為陽性定位;Ki67在胞核中呈棕黃色陽性表達(dá);Caspases-9在胞漿胞核中呈陽性表達(dá);Caspases-3、Caspases-8主要在胞質(zhì)中或胞質(zhì)與胞核共表達(dá)。以細(xì)胞未著色或輕微著色為陰性。每一指標(biāo)觀察3張細(xì)胞爬片，每張片在400×高倍鏡下觀察5個視野，每個視野下分別計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)并計算陽性表達(dá)率。陽性表達(dá)率(%)=陽性細(xì)胞總數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。免疫細(xì)胞化學(xué)染色中以已知陽性物質(zhì)的組織切片為陽性對照，各組均以PBS代替一抗作為陰性對照。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0軟件:數(shù)據(jù)用ˉx±s表示;MTT法檢測的抑制率之間的比較采用t檢驗;用相關(guān)分析與直線回歸計算半數(shù)增殖抑制濃度(IC50);Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9、bcl-2、Ki-67、p21ras陽性表達(dá)統(tǒng)計分析采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

3 結(jié)果

3.1 TUNEL法檢測虎杖提取物對A549細(xì)胞株的誘導(dǎo)凋亡作用 結(jié)果顯示:對照組可見少量的凋亡細(xì)胞，實驗組凋亡細(xì)胞增多。各實驗組，隨著虎杖NaHCO3提取物濃度的增加，凋亡率升高;隨著作用時間的延長，凋亡率升高，見表1。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期改變 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示虎杖NaHCO3提取物濃度為40 μg/mL作用于A549細(xì)胞株24 h，48 h均出現(xiàn)G0/G1期阻滯，阻滯細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化，隨處理時間延長G0/G1期細(xì)胞含量上升，S期細(xì)胞下降;不同時間段各加藥處理組G0/G1期細(xì)胞含量與對照組相比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，呈時間依賴性(P＜0.01)。見表2。

表1 虎杖NaHCO3提取物對人肺癌A549細(xì)胞凋亡率的影響(±s，n=5)

表1 虎杖NaHCO3提取物對人肺癌A549細(xì)胞凋亡率的影響(±s，n=5)

注:與對照組比較，**P＜0.01;與前一組比較，△P＜0.01。

劑量/(μg/mL) 凋亡率/%24 h 48 h 2.10±0.37 3.67±0.71 20 15.20±3.40** 22.45±3.03**40 22.67±2.67**△ 36.17±3.04 0**△

表2 相同時間不同濃度虎杖提取物作用于A549細(xì)胞周期時相分布(ˉ±s，n=8)

表2 相同時間不同濃度虎杖提取物作用于A549細(xì)胞周期時相分布(ˉ±s，n=8)

注:與對照組比較，*P＜0.01。

組別 G0/G1/% S/% G2/M/%A 51.50±3.95 44.83±3.40 3.39±1.17 2.83±1.09虎杖提取物24 h 57.82±3.37* 36.71±4.14* 5.47±1.77* 7.27±2.19*虎杖提取物48 h 65.18±4.74* 24.97±5.77* 9.85±1.87* 9.06±5.42對照組*

3.3 凋亡關(guān)鍵效應(yīng)酶與凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的檢測

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明:虎杖提取物作用于A549細(xì)胞24 h后，40 μg/mL濃度組凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3、Caspase-8與Caspase-9均有表達(dá)，并且表達(dá)具有一致性，各組鏡檢相同;從視野內(nèi)的細(xì)胞著色的深淺可以看出表達(dá)程度的增多和表達(dá)量的增加;統(tǒng)計學(xué)分析采用t檢驗可知:實驗組與對照組比較均P＜0.01;同時提取物濃度與Caspase表達(dá)的關(guān)系具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表3。

表3 用藥前后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的陽性表達(dá)率

光鏡下觀察可見:Ki-67蛋白染色位于細(xì)胞核，bcl-2和p21ras蛋白位于細(xì)胞漿內(nèi)，對照組陽性細(xì)胞數(shù)目多且呈棕黃色，40 μg/mL濃度組實驗組陽性細(xì)胞減少，染色明顯變淺。實驗組與對照組蛋白表達(dá)相比有顯著性差異(P＜0.01)，見表4。

表4 用藥前后Bcl-2、Ki-67、P21ras蛋白的陽性表達(dá)率

4 討論

Ki-67抗原是目前較為肯定的細(xì)胞核增殖標(biāo)志基因，且Ki-67有可能作為確定癌前人群中高危個體的生物學(xué)標(biāo)志物［1］。本實驗Ki-67抗原檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎杖提取物作用于A549細(xì)胞后，Ki-67陽性表達(dá)率隨濃度與時間的增加而減少，實驗組均顯著低于對照組(P＜0.01)，Ki-67表達(dá)明顯減弱，表明大量的癌細(xì)胞處于細(xì)胞增生周期的靜止期。提示虎杖提取物的活性成分作用于肺癌細(xì)胞通過基因調(diào)控來抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而能阻止癌細(xì)胞進(jìn)入分裂期，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。p21ras癌基因參與細(xì)胞內(nèi)信息的傳遞，對細(xì)胞周期起調(diào)節(jié)作用，是腫瘤發(fā)生的“啟動因子”［2］。本實驗p21ras抗原檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎杖提取物作用于A549細(xì)胞后，p21ras陽性表達(dá)率隨濃度與時間的增加而減少，實驗組均顯著低于對照組(P＜0.01)，p21ras表達(dá)明顯減弱，表明大量的癌細(xì)胞處于細(xì)胞增生周期的靜止期。提示虎杖提取物的活性成分作用于肺癌細(xì)胞通過基因調(diào)控來抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而能阻止癌細(xì)胞進(jìn)入分裂期，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。

本實驗流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞加藥處理前后的細(xì)胞周期時相分布結(jié)果顯示:虎杖提取物40 μg/mL處理24 h，48 h后，實驗組與對照組相比，處于G0/G1期細(xì)胞百分含量明顯增加(P＜0.05)。表現(xiàn)出細(xì)胞被阻滯于G0/G1期。實驗表明:虎杖提取物具有明顯的G0/G1期阻滯作用，使進(jìn)入S期的細(xì)胞減少，阻礙細(xì)胞進(jìn)行DNA合成，從而抑制細(xì)胞生長參與完成其細(xì)胞增殖抑制作用。本實驗應(yīng)用TUNEL法觀察虎杖提取物誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞株凋亡的情況，實驗結(jié)果表明:虎杖提取物可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡;隨著作用時間延長和作用濃度的提高，凋亡率升高(P＜0.01);表現(xiàn)為時間依賴性和劑量依賴性。由此可推測在虎杖提取物作用的48 h之內(nèi)其抑制增殖作用主要由誘導(dǎo)凋亡作用而實現(xiàn)，因而完成對腫瘤細(xì)胞的殺傷。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，本實驗中對照組細(xì)胞未出現(xiàn)凋亡峰，凋亡率在一定時間范圍內(nèi)隨著藥物作用時間的增加而上升，實驗組與對照組的相比凋亡率明顯增加(P＜0.05)。FCM的實驗結(jié)果結(jié)合形態(tài)學(xué)的凋亡改變進(jìn)一步表明:虎杖提取物在體外有誘導(dǎo)A549人肺癌細(xì)胞株凋亡的作用。

凋亡機制的核心成分是一類蛋白水解酶，統(tǒng)稱為Caspase家族。Caspase家族是一種半胱胺酸蛋白酶家族，該家族的蛋白酶解級聯(lián)反應(yīng)控制著細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者［3-5］。在本實驗中，實驗組Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)，Caspase-9的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)，根據(jù)上述線粒體通路凋亡機制，可以證明虎杖提取物對細(xì)胞凋亡的線粒體通路的影響。在本實驗中Caspase-3的表達(dá)上調(diào)，而Caspase-3可以直接引起細(xì)胞的凋亡。實驗組Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)明顯高于對照組(P＜0.01)。表明經(jīng)虎杖提取物作用后的A549人肺癌細(xì)胞株可以使Caspase表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。證實了虎杖提取物對細(xì)胞凋亡的死亡受體通路的影響，虎杖提取物誘導(dǎo)凋亡是通過抑制信號傳導(dǎo)通路上相關(guān)酶來實現(xiàn)的，相關(guān)基因bcl-2、Caspase-3、Caspase-8和 Caspase-9蛋白均參與了腫瘤形成和發(fā)展的共同通路，并且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演變過程中可能起著重要的作用。本實驗證明了在虎杖提取物誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中，Caspase在細(xì)胞凋亡的內(nèi)外信號傳導(dǎo)途徑中均參與了虎杖提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，虎杖提取物能影響A549人肺癌細(xì)胞株的凋亡通路。

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