牛麗穎, 王鑫國, 任艷青, 劉 姣, 李 清
(河北醫(yī)科大學中醫(yī)學院河北省實驗動物重點實驗室,河北石家莊050091)
近年來植物雌激素對絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的防治備受關注。研究發(fā)現(xiàn),中藥淡豆豉有明顯的抗骨質(zhì)疏松活性[1,2],但其對骨質(zhì)疏松模型動物骨微細結構的影響目前尚未見報道。本研究采用大鼠去卵巢的方法模擬婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松,通過觀察淡豆豉提取物對骨質(zhì)疏松大鼠骨微細結構的影響,以進一步明確其對骨質(zhì)疏松的防治作用,為開發(fā)淡豆豉資源提供實驗依據(jù)。
1.1.1 藥物 淡豆豉,由本實驗室在《中國藥典》(2005版)淡豆豉制法的基礎上,對其工藝參數(shù)進行量化、優(yōu)選后炮制而成,成品經(jīng)石油醚(60~90℃)脫脂、8倍量70%乙醇回流提取(3次,每次2 h)、大孔樹脂純化,流出液濃縮至4 g生藥/mL,備用;仙靈骨葆膠囊,貴州同濟堂制藥有限公司。
1.1.2 儀器 Reicheit-Jung 2040切片機(德國);Leica Qwin圖象分析系統(tǒng)(德國);Olympus顯微鏡(日本);Opton熒光顯微鏡(德國)。
1.1.3 動物 SD大鼠,♀性,6月齡,由河北省實驗動物中心提供,動物飼料亦由該中心提供;各組大鼠分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件:光照12 h,黑暗12 h,室溫20~24℃,相對濕度40% ~70%,自由飲水、攝食。
將大鼠麻醉后無菌條件下切除雙側(cè)卵巢,假手術組只將卵巢和輸卵管牽引體外,然后再將其返回原處即可,不切除卵巢[3]。術后1周,將手術成功的大鼠按體重分為分為去卵巢模型組、淡豆豉提取物低劑量組(5 g生藥/kg·d)、淡豆豉提取物中劑量組(10 g生藥/kg·d)、淡豆豉提取物高劑量組(20 g生藥/kg·d)及陽性藥仙靈骨葆組(0.5 g/kg·d),每組8只。各組大鼠每天上午灌胃給藥,給藥容量為10 mL/kg,假手術組及去卵巢模型組大鼠給予等容量蒸餾水,連續(xù)12周。各組動物于處死前16 d和前3 d分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30 mg/kg體重,以對骨進行熒光標記。末次給藥后,處死大鼠,取左側(cè)脛骨近端1/3,將脛骨切成5 μm的縱向不脫鈣骨切片,置于熒光顯微鏡下觀察或甲苯胺藍染色后觀察,采用Leica Qwin圖象分析系統(tǒng)進行骨組織形態(tài)計量[4]。各參數(shù)如下:①骨小梁組織形態(tài)計量:骨小梁體積百分比(TBV%)、骨小梁吸收表面百分比(TRS%)、骨小梁形成表面百分比(TFS%)、活性生成表面百分比(AFS%)、骨小梁礦化率(MAR)、骨小梁骨生成率(BFR)。② 皮質(zhì)內(nèi)表面形態(tài)計量:類骨質(zhì)平均寬度(OSW)、骨皮質(zhì)礦化率(mAR)。
去卵巢模型組大鼠骨量參數(shù)TBV%較假手術組大鼠明顯降低(P<0.01),骨吸收參數(shù)TRS%較假手術組大鼠明顯升高(P<0.01);淡豆豉提取物各劑量組大鼠TBV%較去卵巢模型組大鼠明顯升高(P<0.05或P<0.01),TRS%明顯降低(P<0.01),見表1。
表1 淡豆豉提取物對去卵巢大鼠脛骨TBV%和TRS%的影響(ˉx±s)
去卵巢模型組大鼠TFS%、AFS%、MAR和BFR均較假手術組大鼠明顯升高(P<0.01);淡豆豉提取物(20 g生藥/kg)組大鼠TFS%、AFS%較去卵巢模型組大鼠明顯降低(P<0.05);各劑量的淡豆豉提取物均可不同程度地降低大鼠MAR、BFR水平(P<0.05或P<0.01),見表2。
表2 淡豆豉提取物對去卵巢大鼠脛骨TFS%、AFS%、MAR和BFR的影響(±s,n=8)
表2 淡豆豉提取物對去卵巢大鼠脛骨TFS%、AFS%、MAR和BFR的影響(±s,n=8)
注:與去卵巢模型組比較*P<0.05,**P<0.01。
組別 劑 量(g生藥/kg) TFS/% AFS/% MAR/(μm/d) BFR/(μm/d)假手術組 — 8.72±1.94** 8.94±2.07** 0.94±0.14** 7.65±2.31**去卵巢模型組 — 14.46±4.05 15.56±4.66 3.26±1.38 41.42±6.46淡豆豉提取物組 5 12.38±3.35 14.34±2.58 1.76±0.62* 20.27±5.14**10 10.82±2.86 14.96±2.82 1.58±0.22** 20.56±4.41**20 10.36±1.96* 11.06±2.86* 2.01±0.34* 22.16±4.55**仙靈骨葆組 0.5 10.71±2.05* 10.45±2.63* 1.56±0.25** 16.37±3.27**
去卵巢模型組大鼠OSW、mAR較假手術組大鼠明顯升高(P<0.01);去卵巢模型組比較,淡豆豉提取物(20 g生藥/kg)組OSW明顯降低(P<0.01),淡豆豉提取物(10 g生藥/kg、20 g生藥/kg)組mAR明顯降低(P<0.05),見表3。
中醫(yī)并無骨質(zhì)疏松病名,但“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”、“骨極”的描述與骨質(zhì)疏松極為相似。中醫(yī)認為:“腎藏精,精生髓,髓生骨,故骨者,腎之所合也;髓者,腎精所生,精足則髓足,髓在骨內(nèi),髓足則骨強?!惫堑纳L發(fā)育與腎精盛衰關系密切,腎精充足則骨髓生化有源、骨骼得以滋養(yǎng)而強健有力;腎精虧虛則骨髓生化無源、骨骼失養(yǎng)而痿弱無力。婦女絕經(jīng)后,腎氣漸衰,腎精虛少,骨髓化源不足,不能營養(yǎng)骨骼,進而導致骨骼脆弱無力,出現(xiàn)腰脊酸軟疼痛,下肢乏力,遇外力易發(fā)生骨折等骨質(zhì)疏松癥狀,可見,中醫(yī)的腎虛是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要病理生理學基礎[5]。
表3 淡豆豉提取物對去卵巢大鼠脛骨OSW、mAR的影響(±s)
表3 淡豆豉提取物對去卵巢大鼠脛骨OSW、mAR的影響(±s)
注:與去卵巢模型組比較*P<0.05,**P<0.01。
組別 劑 量/(g生藥/kg) 動物數(shù)/只 OSW/μm mAR/(μm/d)假手術組 — 8 7.76±1.68** 2.01±0.81**去卵巢模型組 — 8 12.38±2.67 3.26±0.64淡豆豉提取物組 5 8 10.16±1.36 2.64±0.55 10 8 10.84±2.14 2.51±0.61*20 8 8.35±2.01** 2.56±0.34*仙靈骨葆組 0.5 8 9.74±1.43* 2.46±0.46*
現(xiàn)代研究認為,絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis,PMO)主要是由于雌激素水平下降,破骨細胞所介導的骨吸收增加,骨量減少、骨組織顯微結構退化,以致骨的脆性增高及骨折危險性增加的一種全身性骨病。骨強度既與骨量有關,又與骨的內(nèi)部結構有關。在骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中,骨結構的變化首先表現(xiàn)為骨小梁變細,隨著病程的發(fā)展,骨小梁穿孔、斷裂,最終導致骨小梁數(shù)量減少,連接減少,游離端增多骨的微觀結構退化甚至破壞,這是骨的生物力學性能減退,容易發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的重要原因。Hahn等[6]認為,骨量并不能完全反映松質(zhì)骨的穩(wěn)定性和力學強度,骨結構的減退對骨的整體性能往往更具危害性。增加骨小梁數(shù)目、保護骨的微細結構是治療骨質(zhì)疏松的重要目的之一。骨形態(tài)計量學是對骨結構進行定量分析的重要手段。它能從組織學上,對骨的成分進行分析,可以提供成骨細胞、破骨細胞的活性、骨量的改變以及骨轉(zhuǎn)換率、骨結構的形態(tài)與數(shù)值信息,判斷骨重建的狀況。通過進行四環(huán)素熒光物質(zhì)標記,還可以對骨礦代謝和骨形成過程進行定量分析。
去卵巢模型現(xiàn)已成為研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的經(jīng)典動物模型,本實驗結果表明:大鼠切除卵巢3個月后,作為骨量主要標志的脛骨TBV%顯著降低,而代表骨吸收參數(shù)的TRS%以及代表骨形成參數(shù)的TFS%、AFS%、MAR、BFR、OSW 和 mAR 皆顯著增高,成功地模擬了絕經(jīng)后高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松模型,這一結果與大量的國內(nèi)外文獻報道相一致[7]。給去卵巢大鼠灌服淡豆豉提取物12周后能使上述指標發(fā)生逆轉(zhuǎn),骨的空間微細結構得以改善,對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松有一定的防治作用。淡豆豉的生物活性成分主要為大豆異黃酮,大豆異黃酮的生物活性主要體現(xiàn)在4種主要單體組分上,即染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆苷元,大豆異黃酮在結構和功能上與雌激素有相似之處,因此被認為是植物雌激素。當人體內(nèi)雌激素水平低時,植物異黃酮占據(jù)雌激素受體,發(fā)揮弱雌激素效應[8],也有研究提示大豆苷元比大豆苷能更有效地預防去卵巢大鼠骨丟失[9],本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)大豆經(jīng)炮制后大豆苷元含量明顯增加[10],由此推測淡豆豉可能比大豆具有更強的抗骨質(zhì)疏松作用,進一步的研究仍在進行中。
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