吳 光 侯建全

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，約占泌尿系統(tǒng)原發(fā)腫瘤的45%～70%，其中70%～80%為淺表性膀胱癌。當前對膀胱癌的治療主要是經(jīng)尿道腫瘤切除術輔以膀胱灌注化療，降低腫瘤復發(fā)率及惡化率，但仍有約60%～80%的患者復發(fā)，其中10%～20%將發(fā)展成浸潤性膀胱癌，此時患者需行膀胱全切術且預后極差，因此，尋求更新且有效的治療方法，改善腫瘤患者的生存質量并盡可能保留膀胱，是當前亟待探索和解決的1個課題。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)[1]：125IUdR膀胱灌注可提高局部藥物濃度，延長其在靶器官的滯留時間，并較少對周圍組織的毒副作用。本實驗著重探討在裸鼠原位膀胱癌動物模型125IUdR治療的有效性及安全性，為臨床試驗提供前期工作。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌T24細胞株，為T3期膀胱癌，購于中科院上海生物細胞研究所；BALB/c雌性裸鼠48只，由中國科學院上海實驗動物中心提供，4～5周齡，體重為(15±3)g；Na125Ⅰ由中國原子能科學研究院提供，UdR為Sigma公司產(chǎn)品；絲裂霉素(MMC)由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供；氨甲喋呤(MTX)由浙江萬馬藥業(yè)有限公司提供；Caspase-3購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物模型的制備

參照前期研究[2]，將對數(shù)生長期T24膀胱癌細胞株調整濃度為2×107/ml，1%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，取下腹正中切口，暴露膀胱，自尿道插入22 G靜脈留置針套管，針芯輕劃膀胱左側壁4～5次，PBS液沖洗膀胱3～4次后立即灌注T24細胞懸液0.1 ml(細胞數(shù)約2×106個)，至少保留1 h，并逐層縫合手術切口，每天觀察行為習慣、營養(yǎng)狀況及膀胱區(qū)有無異常腫塊。

1.3 125IUdR的制備

參照前期研究[1]合成125IUdR，將合成的125IUdR溶液和生理鹽水配制成18.5 KBq/10 μl的125IUdR溶液以備用。

1.4 實驗治療分組

種植后1周將36只實驗裸鼠隨機分成4組，即對照組、MMC組、125IUdR組和聯(lián)合組，每組9只，對照組不予任何處理，其余3組分別予1 mg/ml的絲裂霉素0.1 ml、18.5 KBq/10 μl的125IUdR 0.1 ml、18.5 KBq/10 μl的125IUdR 0.1 ml聯(lián)合氨甲喋呤(膀胱灌注前1 h腹腔注射，注射量為20 mg/kg)膀胱灌注，每5天1次，共4次；實驗前3天至實驗當天，125IUdR組及聯(lián)合組裸鼠每日灌入碘化鉀溶液1次，以封閉甲狀腺，第28天每組處死裸鼠3只，解剖膀胱腫瘤并稱重，進一步行病理學檢查。其余實驗裸鼠進行為期60天的生存分析。

1.5 細胞周期分析

第2次膀胱灌注后24 h，對照組、125IUdR組與聯(lián)合組各隨機取3只裸鼠，采用頸椎脫臼法處死，每只切取直徑約3 mm新鮮膀胱腫瘤組織剪碎，經(jīng)300目/mm2濾網(wǎng)過濾制成單細胞懸液，70%冰乙醇固定2 h后以PBS液漂洗3遍，加入碘化丙啶(PI)，于4℃黑暗處靜置30 min后流式細胞儀分析細胞周期。

1.6 實時定量PCR檢測p21基因的mRNA表達

Trizol一步法提取RNA，并用6-隨機引物逆轉錄成cDNA。

p21 正義鏈，5’-ATGTC AGAAC CGGCT GGGGA T-3’；反義鏈，5’-GGGCT TTCCT CTTGG AGAAG AT-3’。內參基因GAPDH正義鏈，5’- GCAAGTTCAACGGCACAG-3’；反義鏈，5’- GCCAGTAGACTCCACGAC-3’。

real-time PCR反應體系：5×Buffer 5 μl，Mg2+0.4 μl，10 mmol的dNTP 0.75 μl，10 mmol的正義引物0.75 μl，10 mmol的反義引物 0.75 μl，Tag酶 0.3 μl，EVA green 1 μl，模板cDNA 2 μl，加H2O至25 μl。

PCR反應 條件：95℃ 變性5 min；95℃ 變性20 s；58℃ 退火20 s；72℃ 延伸20 s，共45個循環(huán)；80℃ 讀板；72℃ 再延伸5 min。反應完成后，將產(chǎn)物于4℃保存。長期保存溫度應是-20℃。

通過2-△△CT方法進行計算目的基因和內參基因的相對拷貝數(shù)。

1.7 Caspase-3蛋白表達的檢測

免疫組化染色采用SP法(Streptavidin-biotin immunoperoxidase method)，Caspase-3為兔抗人IgG。Caspase-3蛋白染色結果判定標準：按照每張切片的陽性細胞比例及著色深淺計分，行半定量分析。陽性細胞所占比例判斷：無著色為0分，1/3以下著色為1分，1/3～2/3著色為2分，2/3以上著色為3分。著色深淺：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項相乘0分為-，1～3分為+，4～6分為++，7～9分為+++；(+)為低表達，(++)為中度表達，(+++)為高表達。

1.8 統(tǒng)計學處理

實驗結果數(shù)據(jù)應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析或χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床觀察

膀胱灌注后第2～3周時對照組恥骨上區(qū)可觸及膀胱質地變硬，輕輕擠壓可見明顯肉眼血尿，3周內各組裸鼠均未見采食飲水、行為習慣的改變；第3～4周時，對照組部分裸鼠出現(xiàn)消瘦、采食飲水及活動量減少，部分裸鼠死于惡病質；MMC組和125IUdR組部分裸鼠出現(xiàn)采食飲水及活動減少；聯(lián)合組裸鼠未見明顯變化。

2.2 實驗裸鼠膀胱腫瘤重量測定

3個治療組裸鼠膀胱腫瘤重量分別為(41.583±4.945)mg、(42.825±2.590)mg和(31.075±3.931)mg，均較對照組輕(P<0.05)，3個治療組抑瘤率分別為33.45%、31.46%和50.27%，其中聯(lián)合組低于MMC組和125IUdR組(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組實驗裸鼠平均膀胱腫瘤重量比較

2.3 病理檢查

HE染色結果顯示：對照組膀胱腔內充滿腫瘤細胞，排列紊亂，異型性明顯，并見腫瘤細胞浸潤肌層；MMC組、125IUdR組膀胱腔內覆蓋腫瘤細胞數(shù)十層，并可見膀胱腔存在，部分腫瘤細胞浸潤肌層，膀胱腔內部分區(qū)域可見腫瘤壞死灶；聯(lián)合組膀胱腔內覆蓋數(shù)層腫瘤細胞，膀胱腔清晰可見，膀胱腔內可見大量的腫瘤壞死灶。

2.4 流式細胞儀分析(FCM)

流式細胞儀分析測定各組腫瘤細胞的G1期、S期百分比和凋亡指數(shù)(AI)。結果顯示：聯(lián)合組腫瘤細胞S期百分比明顯降低，腫瘤細胞大量停滯在G0/G1期，凋亡指數(shù)明顯大于對照組和125IUdR組，并見明顯的凋亡峰。125IUdR組腫瘤細胞S期百分比低于對照組，且凋亡指數(shù)大于后者，見表1。

表1 各組細胞周期分布及凋亡指數(shù)比較

注：△△為聯(lián)合組與對照組比較，P<0.05；△為125IUdR組與對照組比較，P<0.05

2.5 p21基因mRNA的表達

Real-time PCR檢測p21基因mRNA表達結果顯示：3個治療組其表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)，其中聯(lián)合組高于MMC組和125IUdR組(P<0.05)；后兩者之間差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 各組腫瘤細胞p21基因相對拷貝數(shù)比較

2.6 Caspase-3蛋白染色

對照組腫瘤細胞中caspase-3蛋白呈低表達(評分為1.33分)，MMC組、125IUdR組和聯(lián)合組caspase-3蛋白分別呈中度表達、中度表達和高表達(評分分別為4.67、4.67和9分)，均明顯高于對照組，其中聯(lián)合組高于MMC組和125IUdR組，而后兩者之間差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.7 生存分析

對照組裸鼠平均生存時間為29.33天，而MMC組、125IUdR組和聯(lián)合組分別為35.33、36.67和44.67天，均大于對照組(P<0.01)，其中MMC組和125IUdR組平均生存時間較聯(lián)合組短(P<0.01)，MMC組和125IUdR組平均生存時間差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

在輻射致死效應中，基因組DNA(genomic DNA)是細胞內最重要的靶點。125Ⅰ標記的脫氧尿苷(125IUdR)是脫氧胸苷(TdR)類似物，能特異性摻入處于S期細胞的DNA，引起DNA雙鏈斷裂和細胞死亡，屬于細胞周期特異性放射性藥物。膀胱是一理想的藥物灌注囊腔，且膀胱癌多起源于尿路上皮表層，故尤其適合放射性核素標記的藥物使用，且局部應用125IUdR可以維持較高的藥物濃度，又可減輕全身毒副作用。

由于腫瘤細胞呈異質性增殖，某一特定時刻所有腫瘤細胞處于不同的細胞周期，國外學者研究發(fā)現(xiàn)，氨甲喋呤能明顯抑制胸苷酸合成酶(TS)，阻斷內源性脫氧胸苷的合成，并耗盡體內的脫氧胸苷酸儲備，而125IUdR通過補救途徑磷酸化后能替代DNA中的脫氧胸苷酸。Kassis等[3]聯(lián)合應用氨甲喋呤和125IUdR進行研究，氨甲喋呤能阻斷125IUdR在體內的降解，延長125IUdR治療時間，結果發(fā)現(xiàn)體外暴露于氨甲喋呤與125IUdR的腫瘤細胞可以增加125IUdR的攝取及125IUdR在DNA中的插入，提高腫瘤組織與非腫瘤組織放射活性比值；單獨鞘內應用氨甲喋呤療效較差，單獨應用125IUdR療效較好，兩者聯(lián)合應用療效有明顯提高。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在實驗期內聯(lián)合組裸鼠采食飲水、行為習慣等方面無明顯改變，而實驗后期125IUdR組部分裸鼠出現(xiàn)采食飲水減少，活動量逐漸減少；聯(lián)合組裸鼠平均膀胱重量明顯小于125IUdR組，且平均生存時間大于后者。說明氨甲喋呤聯(lián)合125IUdR的療效明顯優(yōu)于125IUdR單獨治療的療效。

本實驗中我們應用流式細胞儀對實驗裸鼠膀胱腫瘤細胞的周期進行了測定，結果顯示聯(lián)合組、125IUdR組腫瘤細胞的S期百分比明顯低于對照組，聯(lián)合組出現(xiàn)明顯的凋亡峰，表明125IUdR俄歇電子內照射治療后主要使腫瘤細胞周期G1、S期檢查點的功能受到干擾，出現(xiàn)G1期阻滯，S期細胞比例下降，氨甲喋呤可增強125IUdR對膀胱腫瘤細胞的凋亡效應。

p21基因是最廣泛的酶抑制活性的細胞周期抑制蛋白，p21蛋白廣泛地結合并抑制Cyclin-cdk復合物(細胞周期素依賴周期素的激酶復合物)，抑制cdk激酶的活性，阻止細胞通過G1/S期關卡，使細胞停留在G1期。劉新等[4]研究發(fā)現(xiàn)p21基因表達缺失可使膀胱腫瘤細胞增殖活躍；Kasasaki等[5]研究顯示p21基因是1種腫瘤抑制基因，在DNA損傷劑引起的細胞凋亡中起重要作用；Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)p21基因與膀胱癌的分級相關。本試驗結果顯示3個治療組腫瘤細胞p21基因mRNA表達水平明顯高于對照組，125IUdR明顯增加了p21基因的表達水平，而其中聯(lián)合組表達水平高于MMC組和125IUdR組，表明氨甲喋呤與125IUdR對膀胱腫瘤細胞p21基因的表達有聯(lián)合促進效應。

Caspase-3是caspase家族中的一員，在參與凋亡的多種caspase中，caspase-3是凋亡執(zhí)行階段的主要效應酶之一，在細胞凋亡過程中處于核心位置，它的激活發(fā)生在凋亡細胞出現(xiàn)特征性形態(tài)改變之前，是凋亡過程的早期事件，caspase-3活性增強，不僅可以表明細胞凋亡的存在，還可表明細胞凋亡的發(fā)生是caspase-3依賴性的。caspase-3的表達表明細胞必定死亡，因此caspase-3被稱為死亡蛋白[7]。本試驗caspase-3蛋白染色結果顯示，對照組腫瘤細胞caspase-3蛋白呈低表達，明顯低于其余3個治療組的表達；聯(lián)合組呈高表達；而MMC組和125IUdR組呈中度表達，與聯(lián)合組之間的差異有統(tǒng)計學意義。表明125IUdR可促進腫瘤細胞的凋亡，而氨甲喋呤與125IUdR有協(xié)同效應。

總之，膀胱內灌注125IUdR對實驗裸鼠膀胱癌的治療安全有效，125IUdR能選擇性的殺傷DNA合成期S期的腫瘤細胞，顯著抑制膀胱癌細胞的增殖，干擾膀胱癌細胞的DNA合成，為125IUdR的臨床應用提供了理論依據(jù)。

[1] 侯建全,周守軍,朱 然,等.大鼠膀胱內灌注125Ⅰ脫氧尿嘧啶核苷的藥代動力學及組織分布〔J〕.中華實驗外科雜志,2006,23(1):90.

[2] 楊慎敏,侯建全,溫端改,等.原位膀胱癌動物模型的建立和應用〔J〕.癌癥,2006,26(4):52.

[3] Kassis AI,Dahman BA,Adalstein SJ.In vivo therapy of neoplastic meningitis with methotrexate and 5-[125I]iodo-2-deoxyuridine〔J〕.Acta Oncologica,2000,39(6):731.

[4] 劉 新,楊春明,孫志熙,等.膀胱癌復發(fā)與p53、p21WAF-1/CIP1和細胞周期素E基因表達的相關性研究〔J〕.中華實驗外科雜志,2002,19(6):495.

[5] Kasasaki T,Tomita Y,Bilim V,et al.Abrogation of apoptosis induced by DNA-damaging agent in human bladder cancer cell lines with p21/WAF1/CIP1 and/or p53 gene alterations 〔J〕.International Journal of Cancer,1996,68(4):501.

[6] Chen WC,Wu HC,Hsu CD,et al.p21 gene codon 31 polymorphism is associated with bladder cancer〔J〕.Urologic Oncology,2002,7(2):63.

[7] Howard Y.Proteases for cell suicide:functions and regulation of caspases〔J〕.Microbiol Mol Biol Rev,2000,64(4):821.