楊 嶸 陳 億 羅開元

結(jié)腸癌發(fā)病率近年來有逐年上升的趨勢，已受到了醫(yī)學界同行的極大關注。盡管外科技術有了很大的改進，但術后復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移仍然是結(jié)腸癌患者的主要死亡原因之一。125Ⅰ粒子組織間植入內(nèi)放射治療結(jié)腸癌的應用在我國有十年左右的歷史，臨床療效較好[1]。但是尚缺乏有說服力的基礎實驗成果為支撐。我們?yōu)樘接?25Ⅰ粒子對低分化結(jié)腸腺癌的治療療效及其作用機制，建立了荷瘤裸鼠皮下移植性低分化結(jié)腸腺癌模型進行實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性BALB/c-nu裸小鼠48只，SPF級，4～6周齡，體重17～18 g，購于中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所。HCT-116人低分化結(jié)腸腺癌細胞株引自美國ATCC，由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所提供。0.4mCi125Ⅰ 粒子及空白粒子購于上海欣科醫(yī)藥有限公司。ABI prism 7300熒光定量PCR儀為美國應用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品，總RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，熒光定量RT-PCR反應體系為Invitrogen公司和Sigma產(chǎn)品，HIF-1α及GAPDH引物采用文獻報道序列并由上海生工生物技術公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備 待HCT-116癌細胞貼壁生長后，取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰酶消化，離心后用生理鹽水吹打成細胞懸液，在無菌實驗條件下，將癌細胞懸液按每只0.2 ml(1×107個細胞)接種于右前肢腋窩皮下，注射局部出現(xiàn)明顯皮丘，4 d后出現(xiàn)結(jié)節(jié)，每隔3天測量腫瘤體積大小，以腫瘤直徑5 mm為成瘤。當瘤體長徑為6～8 mm時，隨機分成對照組及125Ⅰ粒子治療組。125Ⅰ粒子治療組使用18 G穿刺針在距腫瘤邊緣1 cm處穿破皮膚，皮下潛行進入腫瘤組織，進針約12 mm，退出針芯。將一顆0.4 mCi125Ⅰ 粒子置入穿刺針，用圓頭針芯將125Ⅰ粒子輕輕推入腫瘤組織內(nèi)。對照組植入一?？瞻琢Ｗ?0 mCi)，與125Ⅰ粒子治療組做對比。

1.2.2 繪制腫瘤生長曲線圖 每3d使用游標卡尺測量實驗組及對照組腫瘤長徑(a)及寬徑(b)，計算腫瘤體積。腫瘤體積=a×b2/2，并繪制腫瘤生長曲線圖。

1.2.3 計算腫瘤抑瘤率 每7、14、21、28天各處死一批治療組及對照組裸鼠，電子天平秤取瘤重，取平均值，計算抑瘤率。腫瘤抑制率(100%)=(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.2.4 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(FQ-RT-PCR)測定腫瘤組織中HIF-1αmRNA的表達 總RNA抽提及采用RT-PCR 方法，按試劑盒說明書進行操作。HIF- 1α上游引物：5'TCCAAGCCCTCCAAGTAT 3’，下游引物：5 'ATGCTAAATCGGAGGGTA3'，擴增片段為568 bp，將管家基因GAPDH作為內(nèi)對照，上游引物：5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物：5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3’，擴增產(chǎn)物為450 bp。熒光定量PCR反應體系20 μL：cDNA模板1 μL。20 × SYBR GREEN I 熒光染料1μL，10 ×PCR buffer 2 μL，50 mmol/L Mg2+0.8μL，Hot-start Taq ase 0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，去離子水補足至20 μL，每個樣品均做3個復孔。美國應用生物系統(tǒng)公司的7300型實時定量PCR儀器上進行如下反應：95℃ 10 min，95℃ 15 s，59℃ 20 s,68℃ l min 并收集熒光信號，重復40個循環(huán)。PCR結(jié)束后采用溶解曲線確定產(chǎn)物特異性,軟件分析其Ct值；應用△△Ct進行相對定量，校正公式為Fold induction = 2-△△CT；數(shù)據(jù)經(jīng)處理后進行分析比較。

1.2.5 流式細胞儀分析 采用剪碎機械法制備單細胞懸液樣品， PBS洗滌，加入70%冷乙醇固定后重新收集細胞，PBS洗去固定液，加入RNA酶反應過夜，在暗室中碘化丙啶(PI)染色混勻15 min后，應用流式細胞儀作流式細胞分析，汞激發(fā)波長為488 nm，并應用modfit LT 2.0軟件分析細胞周期分布及凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

所有裸鼠均見腫瘤生長，多成橢圓形，移植成功率為100%：粒子植入前，各組間均瘤體積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各時間段處死裸鼠，取出移植瘤標本。肉眼見腫瘤包膜完整，未向四周浸潤。切面瘤體中心是壞死組織，色紅。外圍腫瘤組織呈白色魚肉狀，中間可見銀色金屬短棒即是植入的125Ⅰ粒子。移植瘤光鏡下HE染色證實為低分化結(jié)腸腺癌。

2.1 125Ⅰ粒子治療組及對照組腫瘤體積測量結(jié)果(表1)(圖1)

表1 荷瘤裸小鼠皮下移植瘤體積檢測結(jié)果

125Ⅰ粒子治療組較對照組腫瘤體積明顯縮小，瘤重減輕(P<0.05)。

圖1 植入125Ⅰ粒子后腫瘤生長體積變化曲線圖

從各組的生長曲線看，對照組的腫瘤生長曲線高抬，粒子植入后第10天可見生長曲線明顯上抬，表明腫瘤生長速度顯著增快，而治療組生長曲線一直低平，無明顯曲線斜率抬高現(xiàn)象。

2.2 125Ⅰ粒子對HCT-116細胞移植瘤抑瘤率的影響 (表2)

表2 125Ⅰ粒子治療組與對照組瘤重變化

治療組荷瘤裸鼠在125Ⅰ粒子植入第3周時，瘤重明顯輕于對照組，腫瘤生長受明顯抑制，兩組瘤重差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。治療組第四組瘤重為(1.131±0.079)g，對照組第四組瘤重為(2.139±0.094)g，抑瘤率為47.12%。

2.3 125Ⅰ粒子對裸鼠人結(jié)腸癌移植瘤HIF-1αmRNA表達的影響

經(jīng)125Ⅰ粒子連續(xù)內(nèi)照射后，1、2、3、4周治療組HIF-1αmRNA表達水平均下調(diào)(圖2、圖3)，各治療組與其對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，治療組2、3、4周分別與第1周比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

圖2 125Ⅰ粒子作用1、2、3、4周對HCT-116細胞HIF-1αmRNA表達的影響

圖3 治療組和對照組HIF-1αmRNA表達變化趨勢圖

2.4 流式細胞儀分析細胞周期的再分布

125Ⅰ粒子治療組細胞周期發(fā)生了再分布，見表3。治療組G2/M期與對照組比較：隨著治療時間的延長呈逐漸增加的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；S期及G0/G1期未發(fā)生改變，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 流式細胞儀檢測細胞周期分布結(jié)果

3 討論

125Ⅰ粒子組織間植入治療結(jié)腸癌的臨床應用在我國已有10年歷史，并已證實該方法是一項有效的治療手段[2]。但該技術治療低分化結(jié)腸腺癌的基礎研究國內(nèi)外少有報道。

本實驗結(jié)果提示：125Ⅰ粒子植入到人結(jié)腸癌HCT-116裸鼠皮下移植瘤中，可以明顯抑制瘤體的生長，延長瘤體倍增時間。經(jīng)測量瘤重計算得出第28天時腫瘤抑瘤率為47.12%。

腫瘤細胞增殖能力是決定其生長速度的重要因素，低分化結(jié)腸腺癌由于其惡性程度較高，增殖能力較強而導致其預后不佳。缺氧誘導因子-1(HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的1種轉(zhuǎn)錄因子，由α、β 2個亞基組成。HIF-1β為基礎表達蛋白，HIF-1α為氧調(diào)節(jié)蛋白，決定著HIF-1的活性[3]。HIF-lα在常氧狀態(tài)下極不穩(wěn)定，而在細胞處于低氧條件時，HIF-α在多種組織細胞中表達水平增高，其穩(wěn)定性和活性也相應增加。因此，低分化結(jié)腸腺癌由于其生長速度較快，超過周圍血管的生長速度而導致局部缺氧，進而誘導HIF-1α的過度表達。而HIF-1α能增強其下游靶基因VEGF的表達，活化的HIF-1α與靶基因上的H1F-1α結(jié)合位點結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物，從而啟動靶基因轉(zhuǎn)錄和相應的蛋白產(chǎn)物增加，VEGF表達增加，VEGF進而作用于血管內(nèi)皮細胞表面的血管內(nèi)皮生長因子受體VEGFR1和VEGFR2，從而激活了一系列的缺氧轉(zhuǎn)導通路，誘導新血管的生成，促進腫瘤的生長[4]。本實驗從基因水平上證實125Ⅰ粒子持續(xù)低劑量照射能夠誘導腫瘤細胞HIF-1αmRNA表達下調(diào)，在一定的時間范圍內(nèi)存在時-效關系。

125Ⅰ粒子持續(xù)低劑量照射可以改變HCT-116大腸腺癌細胞周期分布。本實驗通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)隨著低劑量持續(xù)照射，治療組細胞周期阻滯于G2/M期，該期對放射線最敏感，限制腫瘤細胞增殖繼而促進腫瘤細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，125Ⅰ粒子近距離照射治療低分化結(jié)腸腺癌的療效在本實驗中得以肯定。臨床術前可通過TPS計劃系統(tǒng)計算粒子植入具體位置及劑量大小，術中及術后結(jié)合其他方法綜合治療，相信該治療方法在未來會有更加廣闊的應用前景。

[1] 羅開元，李 波，楊 嶸，等.125Ⅰ粒子組織間放射治療惡性腫瘤的臨床應用〔J〕.中華醫(yī)學雜志，2001，12：754.

[2] 羅開元，邵慶華，楊國凱，等.125Ⅰ粒子植入在低位直腸癌保肛術中的應用〔J〕.中華醫(yī)學雜志，2005，19：1355.

[3] Gassmann M，Chilov D，Wenger H.Regulation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha ARNT is not necessary for hypoxic induction of HIF-1 alpha in the nucleus〔J〕.Adv Exp Med Biol，2000，475：87.

[4] 宋冬梅，張麗莎，王寶山，等.低氧條件下人參皂甙Rg3誘導人喉鱗癌細胞凋亡及對HIF-1α和VEGF表達的影響〔J〕.腫瘤防治研究，2008，35(8)：533.