李 艷，賈紅梅,*，Deuther-Conrad Winnie，Brust Peter，Steinbach Joerg，劉伯里

1.放射性藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，北京 100875;2.Forschungszentrum Dresden-Rossendorf, Institute of Radiopharmacy/Neuroradiopharmaceutical Division, 04318 Leipzig, Germany

目前，惡性腫瘤在我國已成為危害人們健康的頭號(hào)殺手。乳腺癌、前列腺癌、肺癌等呈逐年上升趨勢。研究表明，σ受體在許多腫瘤細(xì)胞系中有高度表達(dá)[1]，在腫瘤診斷和治療方面有廣泛的應(yīng)用[2]。目前σ受體至少有兩種亞型被確認(rèn)：σ1型和σ2型受體[3]。其中，σ2受體是腫瘤增殖的生物標(biāo)志[4-6]。

圖1 吲哚類化合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the Indole compounds

Mach等[7]認(rèn)為，用于固體瘤增殖期顯像的PET放射性示蹤劑主要有兩種：一是放射性核素標(biāo)記的核酸類似物(DNA前體)，如[18F]FLT等，但該類顯像劑的缺點(diǎn)是只能標(biāo)記處于增殖期的部分腫瘤細(xì)胞，常常低估腫瘤增殖狀態(tài)；另一種就是放射性核素標(biāo)記的σ2受體示蹤劑，該類顯像劑可以標(biāo)記所有腫瘤細(xì)胞，可以更好地估計(jì)腫瘤增殖狀態(tài)。因此，與σ2受體有高親和力和選擇性的放射性示蹤劑是優(yōu)良的腫瘤顯像劑，其研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[8]。Perregaard 等[9]報(bào)道了一系列對(duì)σ2受體具有較高親和力和選擇性的吲哚類化合物，該類代表化合物的結(jié)構(gòu)示意圖示于圖1，IC50值列入表1。為了設(shè)計(jì)吲哚類腫瘤SPECT顯像劑，首先在與哌嗪環(huán)相連的苯環(huán)對(duì)位引入碘原子，設(shè)計(jì)123I標(biāo)記的吲哚類化合物。由于99Tcm核素優(yōu)良的核性質(zhì)及便宜易得等優(yōu)點(diǎn)，保留可能是配體與σ2受體作用的藥效團(tuán)吲哚環(huán)部分，將99Tcm-MAMA螯合基團(tuán)取代哌嗪環(huán)，采用整體法設(shè)計(jì)99Tcm標(biāo)記的配合物。在此基礎(chǔ)上，合成其穩(wěn)定化合物 (Indole-I和Indole-MAMA-Re)并進(jìn)行體外生物評(píng)價(jià)。制備了標(biāo)記前體(Indole-MAMA)和99Tcm-Indole-MAMA，為設(shè)計(jì)合成用于SPECT顯像的123I和99Tcm標(biāo)記的吲哚類σ2受體腫瘤顯像劑提供了參考。

表1 吲哚類化合物的IC50值Table 1 IC50 values of indole compounds

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑、材料和儀器

吲哚丁酸、氟哌啶醇，分析純，美國Aldrich公司；對(duì)氟碘苯、N,N-二異丙基乙胺(DIEA)，分析純，比利時(shí)Acros公司；氧化鋅、碘化亞銅，分析純，三苯基磷，化學(xué)純，北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；三氟乙酸，化學(xué)純，美國Alfa公司；氫化鋁鋰、甲基吡咯烷酮、溴代琥珀酰亞胺，化學(xué)純，三乙胺、無水碳酸鉀，分析純，北京化工廠；三乙基硅烷，化學(xué)純，北京金龍化學(xué)試劑有限公司；苯甲醚，化學(xué)純，北京市東環(huán)聯(lián)合化工廠；[3H]鎮(zhèn)痛新，1 354 GBq/mmol，美國Perkin Elmer Life Sciences；[3H]DTG，1 147 GBq/mmol，美國NEN Life Science Products；烯丙右嗎喃氫溴酸鹽(Dextrallorphan hydrobromide)，獲贈(zèng)于Hoffman-La Roche, Basel, Switzerland；99Mo-99Tcm發(fā)生器由中國原子能科學(xué)研究院提供。

AVATAR 360型紅外譜儀，美國Nicolet公司；Avance 500 MHz型核磁共振譜儀，Avance Ⅲ 400 MHz型核磁共振譜儀，均為瑞士Bruker公司；GC2000/TRACETMMS 質(zhì)譜儀，美國Finigan公司；240C 型元素分析儀，美國Perkin-Elmer公司；SCL-10AVP高效液相色譜儀，日本島津公司；Alltima C18反相柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，美國Alltech公司；Class-Packard 500 TR系列的放射性檢測器，美國Packard Bioscience公司。

1.2 Indole-I和Indole-MAMA-Re的合成

1.2.11-(4-氟苯)-3-(4-(4-(4-碘苯)哌嗪-1-)丁基)-1H-吲哚(Indole-I)的合成 Indole-I的合成路線示于圖2。4-(1-(4-氟苯)-1H-吲哚-3-)丁醇(化合物1)的合成參考文獻(xiàn)[9]?；衔?與N-溴代丁二酰亞胺(NBS)、Ph3P反應(yīng)生成3-(4-溴丁基)-1-(4-氟苯)-1H-吲哚 (化合物2)，化合物2與1-(4-碘苯)哌嗪反應(yīng)生成1-(4-氟苯)-3-(4-(4-(4-碘苯)哌嗪-1-)丁基)-1H-吲哚(化合物3)。

圖2 Indole-I的合成路線Fig.2 Synthetic route of Indole-I

(1) 3-(4-溴丁基)-1-(4-氟苯)-1H-吲哚(化合物2)的合成

將150 mg化合物1(0.53 mmol)、Ph3P 170 mg(0.64 mmol)、NBS 110 mg(0.63 mmol)溶于3 mL THF中，在冰浴條件下攪拌2 h，過濾后旋去溶劑，過柱分離，展開劑為乙酸乙酯和石油醚的混合溶液，體積比為1∶10?；衔?的產(chǎn)率為82%。

(2) 1-(4-氟苯)-3-(4-(4-(4-碘苯)哌嗪-1-)丁基)-1H-吲哚(化合物3)的合成

將100 mg化合物2(0.29 mmol)、80 mg 1-(4-碘苯)哌嗪(0.77 mmol)、400 mg K2CO3(2.9 mmol)、50 mg KI(0.29 mmol)溶于10 mL乙腈中，加熱到80 ℃，回流6 h。過濾，旋去溶劑后過柱分離，展開劑為乙酸乙酯和石油醚的混合溶液，體積比為1∶4?；衔?的產(chǎn)率為68%。

1.2.2Indole-MAMA-Re的合成 Indole-MAMA-Re的合成路線示于圖3?；衔?與螯合基團(tuán)反應(yīng)生成Indole-MAMA-Tr(化合物4)，后經(jīng)脫保護(hù)反應(yīng)生成Indole-MAMA(化合物5)，再與Re螯合生成Indole-MAMA-Re(化合物6)。

(1) Indole-MAMA-Tr(化合物4) 的合成

將100 mg化合物2(0.29 mmol)溶于2 mL干乙腈中，加入208 mg MAMA-Tr(0.44 mmol)、65 mgN,N-二異丙基乙胺(DIEA)，N2保護(hù)下，加熱到80 ℃回流12 h，旋干混合物，過柱分離，展開劑為乙酸乙酯和石油醚的混合溶液，體積比為1∶1?；衔?的產(chǎn)率為27%。

(2) Indole- MAMA(化合物5)的合成

冰鹽浴下，將70 mg化合物4(0.1 mmol)溶于8 mL CF3COOH中，加入0.25 mL苯甲醚，反應(yīng)15 min后，加入0.2 mL三乙基硅烷，再反應(yīng)20 min，溶液變?yōu)榘咨鞚嵋?，旋干混合物，油泵抽干。產(chǎn)物未經(jīng)純化直接進(jìn)行下步反應(yīng)。

(3) Indole-MAMA-Re(化合物6)的合成

將上步的反應(yīng)產(chǎn)物5，在N2保護(hù)下，溶于9 mL甲醇中，加入50 mg(Ph3P)2ReOCl3(0.060 mmol)和1.5 mL NaAc/CH3OH (1 mol/L)，緩慢升溫至80 ℃，回流6 h，用乙酸乙酯稀釋反應(yīng)混合物，過濾，再用乙酸乙酯洗2次，過濾，得到紫色濾液，旋干后，過柱分離，展開劑為乙酸乙酯和石油醚的混合溶液，體積比為1∶1?；衔?的產(chǎn)率為20%。

圖3 Indole-MAMA-Re的合成路線Fig.3 Synthetic route of Indole-MAMA-Re

1.3 化合物的受體結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)

1.3.1σ1和σ2受體的制備 Indole-I和Indole-MAMA-Re對(duì)σ1受體和σ2受體的親和力在富含各自σ受體亞型的組織中測定[10]:分別在大鼠腦組織勻漿和在大鼠肝組織勻漿中進(jìn)行。動(dòng)物的使用遵循德國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物使用法規(guī)。σ1和σ2受體的制備方法與文獻(xiàn)[11]方法相同。

1.3.2Indole-I和Indole-MAMA-Re與σ1受體和σ2受體親和力的測定 Indole-I和Indole-MAMA-Re 的體外親和力用競爭結(jié)合分析法測定，方法與文獻(xiàn)[11]一致。簡言之，對(duì)σ1受體的親和力用大鼠腦皮質(zhì)膜蛋白和0.8 nmol/L[3H]鎮(zhèn)痛新進(jìn)行測定，對(duì)σ2受體的親和力用大鼠肝膜蛋白和0.8 nmol/L [3H]DTG在10 μmol/L 烯丙右嗎喃存在下以封閉σ1受體的條件下進(jìn)行測定。膜蛋白在冰上解凍后，用培養(yǎng)緩沖溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4，21 ℃)稀釋，再次勻漿。實(shí)驗(yàn)的蛋白濃度用二喹啉甲酸(BCA)方法測定。非特異性結(jié)合試劑采用10 μmol/L 氟哌啶醇。待測化合物的溫育溫度和時(shí)間分別為21 ℃和120 min。所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。用迭代非線性曲線擬合法得出參數(shù)IC50值。應(yīng)用Cheng-Prusoff 方程由IC50值計(jì)算得出抑制常數(shù)(Ki)值。

(1)

c(LT)為放射性配體的濃度，Kd為放射性配體與受體結(jié)合的平衡解離常數(shù)。

1.4 99Tcm-Indole-MAMA的放射化學(xué)合成及純化

1.4.199Tcm-Indole-MAMA的合成 將2 mg配體5溶于2 mL乙醇中，形成1 g/L配體溶液。取200 μL99Tcm-GH，加入100 μL配體溶液，調(diào)節(jié)pH=5.5～6.0，在80～90 ℃的水浴中加熱30 min，冷卻后，用飽和NaHCO3溶液中和至pH=7，薄層色譜法測定標(biāo)記率，展開體系：生理鹽水/聚酰胺片。

1.4.299Tcm-Indole-MAMA的純化及HPLC分析 采用高效液相系統(tǒng)配置Packard 500 TR系列的放射性檢測器，Alltech C18反相柱，淋洗條件為梯度淋洗，流速為1 mL/min。流動(dòng)相淋洗條件列入表2。

表2 流動(dòng)相淋洗條件Table 2 Eluent condition of the mobile phase

注(Note):1)φ(TFA)=0.1%

2 結(jié)果與討論

2.1 中間體及目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

Indole-I和Indole-MAMA-Re的結(jié)構(gòu)及中間體均通過IR、NMR、MS分析確證。

(1) 化合物2

IR：3 051、2 933、1 511、1 459、1 434、1 383、1 220、1 133、839、741 cm-1。1H NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.66(d,J=9.7 Hz,1H),7.46～7.50(m,3H),7.20～7.29(m,4H),7.12(s,1H),3.50(t,J=6.6 Hz,2H),2.87(t,J=7.6 Hz,2H),2.00～2.06(m,2H),1.91～1.97(m,2H)。EI-MS:理論值，345.02;計(jì)算值，345.05。

(2) 化合物3

1H NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.69(d,J=7.8 Hz,1H),7.55(d,J=8.0 Hz,2H),7.47～7.50(m,3H),7.19～7.28(m,4H),7.13(s,1H),6.72(d,J=8.0 Hz,2H),3.23(brs,4H),2.88(t,J=7.2 Hz,2H),2.65(brs,4H),2.51(brs,2H),1.81～1.86(m,2H),1.72(brs,2H)。13C NMR(125 MHz,CDCl3):δ 161.8、159.8、150.8、137.8、136.3、128.9、125.9、125.1、122.5、119.8、119.3、118.1、116.5、116.3、110.2、81.4、58.5、53.0、48.6、27.9、26.7、24.9。EI-MS:理論值，553.35;計(jì)算值，553.14。

(3) 化合物4

IR：3 366、3 055、2 927、1 676、1 594、1 511、1 489、1 458、1 444、1 221、840、742、700 cm-1。1H NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.29～7.52(m,16H),7.07～7.19(m,22H),6.91(s,1H),2.94(d,J=5.4 Hz,2H),2.77(s,2H),2.65(t,J=6.6 Hz,2H),2.31～2.32(m,2H),2.26～2.27(m,3H),2.17～2.18(m, 2H),1.59(t,J=6.8 Hz,2H),1.39～1.50(m,4H)。

(4) Indole- MAMA

產(chǎn)物未經(jīng)純化直接進(jìn)行下步的反應(yīng)。

(5) Indole-MAMA-Re

1H NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.01～7.21(m,8H),6.80(t,1H),4.59～4.66(m,2H),4.06～4.14(m,4H),3.55～3.58(m,2H),3.36(m,2H),3.20～3.28(m,4H),1.90(m,4H)。EI-MS:理論值，659.39;計(jì)算值，659.11。

2.2 Indole-I和Indole-MAMA-Re對(duì)σ受體的親和力和選擇性

通過競爭結(jié)合曲線求得Indole-I和Indole-MAMA-Re抑制放射性配體與σ1受體或σ2受體結(jié)合一半時(shí)所需的濃度IC50值?；衔颕ndole-I、Indole-MAMA-Re對(duì)σ2受體的競爭結(jié)合曲線示于圖4。通過Cheng-Prusoff方程得到上述兩個(gè)化合物對(duì)σ1受體和σ2受體的抑制常數(shù)Ki值列入表3。

對(duì)于本工作研究的吲哚類化合物，在吲哚環(huán)的N原子上引入4-氟苯基，可大大提高化合物對(duì)σ2受體的親和力和選擇性[9]。而當(dāng)哌嗪環(huán)相連的苯環(huán)上沒有取代基時(shí)，化合物對(duì)σ2受體的親和力(IC50=0.69 nmol/L)和選擇性(Ki(σ1)/Ki(σ2)=39)均較高，而在該苯環(huán)引入F原子后，化合物對(duì)σ1受體(IC50=440 nmol/L)和σ2受體(IC50=7.5 nmol/L)的親和力均降低，但仍保持對(duì)σ2受體的高亞型選擇性(Ki(σ1)/Ki(σ2)=59)。由表3和圖4可知，當(dāng)在該苯環(huán)引入碘原子后，化合物對(duì)σ2受體(Ki(σ2)=0.162 μmol/L)的親和力和亞型選擇性(Ki(σ1)/Ki(σ2)=3.5)均降低。因此，在哌嗪環(huán)的苯環(huán)上不宜引入體積大的鹵素取代基。若用Re-MAMA螯合基團(tuán)替代哌嗪環(huán)部分，化合物對(duì)σ1受體(Ki=3.75 μmol/L)、σ2受體(Ki= 7.83 μmol/L)的親和力均降低到μmol/L數(shù)量級(jí)，說明哌嗪環(huán)部分也是配體受體的重要結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)Glennon[12-13]提出的σ1和σ2受體配體的藥效團(tuán)模型，σ1和σ2受體配體都應(yīng)具有1個(gè)堿性氮原子和2個(gè)疏水性區(qū)域。比較Re-MAMA螯合基團(tuán)與哌嗪環(huán)的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，MAMA的N原子與Re原子配位后可能失去堿性N原子的特征，Re-MAMA螯合基團(tuán)由于存在酰胺鍵導(dǎo)致脂溶性降低，也就是說，用Re-MAMA螯合基團(tuán)替代哌嗪環(huán)部分后，可能影響了配體受體的2個(gè)作用位點(diǎn)，所以導(dǎo)致配體對(duì)σ1和σ2受體的親和力都大大降低。由于希望得到99Tcm標(biāo)記的σ2受體顯像劑，需要降低該配合物對(duì)σ1受體的親和力，提高配合物對(duì)σ2受體的親和力，從而提高亞型選擇性，因此，利用整體法設(shè)計(jì)99Tcm標(biāo)記的受體配體時(shí)，需要慎重選擇99Tcm螯合基團(tuán)以及替換原配體結(jié)構(gòu)的部位，破壞配體對(duì)σ1受體的作用位點(diǎn)，而盡量保持配體對(duì)σ2受體的作用位點(diǎn)，只有這樣才有可能得到對(duì)σ2受體具有高親和力和高亞型選擇性的99Tcm標(biāo)記的σ2受體顯像劑。因此希望在本工作化合物的基礎(chǔ)上，通過進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾，提高化合物對(duì)σ2受體的親和力。

圖4 化合物Indole-I(a)、Indole-MAMA-Re(b)與[3H]DTG對(duì)σ2受體的競爭結(jié)合曲線Fig.4 Competition curves of [3H]DTG binding to σ2 receptors in rat liver by Indole-I(a) and Indole-MAMA-Re(b)

化合物(Compounds)Ki(σ1)/(μmol·L-1)Ki(σ2)/(μmol·L-1)Ki(σ1)/Ki(σ2)Indole?I0574±03550162±003035Indole?MAMA?Re375±222783±48705

注(Note)：n=3

2.3 99Tcm-Indole-MAMA的標(biāo)記及99Tcm-Indole-MAMA與Indole-MAMA-Re的HPLC分析

99Tcm-GH的標(biāo)記率大于99%,采用配體交換法制備99Tcm-Indole-MAMA的標(biāo)記率為47%。經(jīng)HPLC分析后，99Tcm-Indole-MAMA的放化純大于90%。純化后經(jīng)HPLC分析，穩(wěn)定配體Indole-MAMA-Re在C18反相柱上的保留時(shí)間為27.6 min(圖5)，標(biāo)記化合物99Tcm-Indole-MAMA的保留時(shí)間為28.5 min(圖6)，兩者保留時(shí)間僅相差0.9 min，說明制備的標(biāo)記物為99Tcm-Indole-MAMA。

圖5 Indole-MAMA-Re的HPLC譜圖 Fig.5 HPLC analysis of Indole-MAMA-Re

圖6 99Tcm-Indole-MAMA 的HPLC譜圖Fig.6 HPLC analysis of 99Tcm-Indole-MAMA

3 結(jié) 論

以對(duì)σ2受體具有高親和力和高亞型選擇性的1-(4-氟苯)-3-[4-(4-苯-1-哌嗪)-1-丁基]-1H-吲哚配體為先導(dǎo)化合物，設(shè)計(jì)了放射性碘和99Tcm標(biāo)記的吲哚類σ2受體腫瘤放射性示蹤劑，合成了其穩(wěn)定化合物 (Indole-I和Indole-MAMA-Re) 和標(biāo)記前體(Indole-MAMA)，測定了Indole-I和Indole-MAMA-Re對(duì)σ1和σ2受體的親和力。結(jié)果表明，在哌嗪環(huán)的苯環(huán)上不宜引入體積大的鹵素取代基，在設(shè)計(jì)99Tcm標(biāo)記物時(shí)，必須在保持σ2受體配體作用位點(diǎn)的前提下引入99Tcm螯合基團(tuán)。99Tcm-Indole-MAMA與Indole-MAMA-Re的HPLC分析結(jié)果表明，制備的99Tcm-Indole-MAMA放化純大于90%。今后可在本文化合物的基礎(chǔ)上通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化，設(shè)計(jì)合成對(duì)σ2受體具有高親和力和選擇性的吲哚類SPECT腫瘤顯像劑。

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