呂 梅，徐爾東，杜翠萍，姚藝文，翟立杰

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科，遼寧 大連 116011)

頭頸部腫瘤是國(guó)際上發(fā)病率最高的癌癥之一。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，其發(fā)生率位居世界第6位，在亞洲國(guó)家發(fā)生率最高，在北歐相對(duì)較低。而95%頭頸部惡性腫瘤來源于上皮層，即鱗狀細(xì)胞癌。它們主要分布于1)上呼吸道，包括鼻腔、副鼻竇、鼻咽部及喉部；2)口腔和下咽部。其他頭頸部的惡性腫瘤則主要來源于大、小涎腺[1]。由于組織病理學(xué)的一致性，人們往往一起研究及總結(jié)這些腫瘤的遺傳學(xué)規(guī)律。

有關(guān)頭頸部鱗狀上皮細(xì)胞癌的細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明，其染色體畸變的類型不同于像血液腫瘤所表現(xiàn)的簡(jiǎn)單、特異性、平衡性的染色體重排；主要表現(xiàn)為復(fù)雜、多倍體的、非平衡性的染色體重排，然而其畸變的規(guī)律卻是非任意性的[2]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)18個(gè)來源于頭頸部不同位置的鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收集分裂中期細(xì)胞，進(jìn)行染色體“G”帶染色，分析核型，并與以往的研究結(jié)果進(jìn)行對(duì)照總結(jié)，進(jìn)一步探討頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的染色體變異規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

18例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(來源于鼻腔、鼻竇5例，鼻咽部3例，口腔部4例，喉部6例)由香港大學(xué)解剖教研室Sai-Wah Tsao教授贈(zèng)給。

2例下鼻甲黏膜上皮(來自鼻整形病人)，1例鼻咽部黏膜上皮(來自鼻咽癌患者正常側(cè)活檢)，1例癌旁組織(來自喉癌患者)短期傳代(≤4代)細(xì)胞培養(yǎng)作為陰性對(duì)照，臨床標(biāo)本均來自大連醫(yī)科大學(xué)附屬一院。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系在RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清，100 IU/mL青霉素，0.2 mg/mL鏈霉素和2.5 μg/mL二性霉素)中培養(yǎng)。正常對(duì)照上皮組織剪碎后，經(jīng)180 U/mL膠原酶Ⅱ，37 ℃孵育過夜；然后放入膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。其培養(yǎng)液為角化細(xì)胞培養(yǎng)液(含0.23 mg/mL的L-谷酰胺，100 IU/mL青霉素，0.2 mg/mL鏈霉素，和2.5 μg/mL二性霉素)。細(xì)胞大體生長(zhǎng)狀態(tài)是在倒置顯微鏡下觀察。

1.3 分裂中期細(xì)胞染色體“G”帶染色

培養(yǎng)細(xì)胞在收獲之前，培養(yǎng)液中加入秋水仙堿(0.01 μg/mL)作用12 h，0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞脫壁。0.06 M KCl低滲處理細(xì)胞35 min，再由固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)固定。將3～4滴細(xì)胞懸液滴于一張浸于4 ℃水中備用載玻片上，60 ℃烘烤過夜。然后將玻片浸于2×SSC中，60 ℃作用3 h。最后賴特氏染液(BDH Burr)作用1 min 30 s。

1.4 細(xì)胞染色體核型分析

100倍光學(xué)顯微鏡下找到分裂中期細(xì)胞，拍攝分散的染色體。利用細(xì)胞遺傳學(xué)影像分析軟件(Newcatlte,UK)編排染色體，根據(jù)國(guó)際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名法(ISCN1995)標(biāo)準(zhǔn)描述細(xì)胞染色體核型。

2 結(jié) 果

4例對(duì)照組上皮細(xì)胞均表現(xiàn)為人正常染色體核型(圖1)。18例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系核型主要表現(xiàn)為大量復(fù)雜的、不平衡性結(jié)構(gòu)重排和染色體數(shù)目的改變(圖2)。但這種畸變并不是隨機(jī)的，而是有規(guī)律可循的。

2.1 染色體成分/數(shù)目的改變

與每個(gè)細(xì)胞系染色體所接近的整倍體數(shù)目比較，主要表現(xiàn)為染色體成分/數(shù)目的丟失(15例，83%)。

2.2 染色體/臂成分的失衡

染色體/臂成分的丟失主要表現(xiàn)為：2q，3p，4，8p，9p，13，14，15，17，18，21，22；染色體/臂成分的增加主要表現(xiàn)為：3q，7，8q，11q13，20 (表1)。

表1 18例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系染色體/臂成分的失衡主要表現(xiàn)Tab 1 Chromosomal imbalances in 18 cases of HNSCC cell lines

2.3 染色體斷裂點(diǎn)部位

大量的染色體斷裂點(diǎn)位于著絲粒區(qū)域,347個(gè)斷裂點(diǎn)中含位于中心體區(qū)域的斷裂點(diǎn)208個(gè)(58%)。本實(shí)驗(yàn)斷裂點(diǎn)出現(xiàn)在著絲粒區(qū)域，即斷裂點(diǎn)出現(xiàn)在著絲粒帶p10和q10；或近著絲粒帶p11和q11，主要表現(xiàn)為等臂染色體形成，整條染色體臂的易位和丟失；常常涉及到的斷裂點(diǎn)主要有1p11-q11，3p11-q11，5p11-q11，7p11-q11，8p11-q11，14p11-q11 (表2)。

圖1 正常對(duì)照組細(xì)胞染色體為人正常有核細(xì)胞染色體核型(×1000)Fig 1 The cellular chromosomes of normal control group showed normal human chromosome karyotype(×1000)

90-101,XXXX,+X,del(X)(p11),del(1)(q31),+der(1)t(1;4)(q11;q11),der(3)t(1;3) (p13;q11) hsr(1;3)(p13;q11) ×2,-4,+6,+7,+7,+9,der(11) add(11) (q13) hsr(11)(q13),-13,-13,-14,?add(14)(q32),-18,-21,-22,mar1,mar2

圖2-1 喉鱗狀細(xì)胞癌
Fig 2-1 Laryngeal squamous cell carcinoma

71-81,XX,-Y,+2,t (2;16)(q33;q24),i(3)(q10) ×2,der(3)t(3;7)(p25;q11) ×2,-4,+ i(8)(q10) ×2,+9,+11,+dup(14)(q22q23),+15,+17,-18,+20,+21

圖2-2 舌鱗狀細(xì)胞
Fig 2-2 Glossal squamous cell carcinoma
圖2 HNSCC組具有代表性染色體畸變的核型(×1000)
Fig 2 The representative chromosomal karyotype of HNSCC cell lines(×1000)

表2 18例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系染色體著絲粒區(qū)域斷裂點(diǎn)Tab 2 Chromosomal breakpoints at centromeric regions in 18 cases of HNSCC cell lines

3 討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展演變過程同時(shí)也是基因組不斷變化的積累過程。癌基因和抑癌基因是與腫瘤形成密切相關(guān)的兩類效應(yīng)基因。癌基因的前體是原癌基因，原癌基因具有調(diào)控細(xì)胞正常生長(zhǎng)和分化的能力。癌基因的激活主要是通過原癌基因的點(diǎn)突變、病毒插入、染色體異位及基因擴(kuò)增等引起，并將導(dǎo)致細(xì)胞無限制的增殖。抑癌基因主要抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞死亡。當(dāng)抑癌基因在突變、缺失、部分或全部染色體丟失的情況下失活后，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖[3]。因此，癌基因活化及抑癌基因失活的逐漸積累促進(jìn)了腫瘤的惡性發(fā)展。而染色體增加、丟失、斷裂、重組的過程直接導(dǎo)致了基因組的變異。

在本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞內(nèi)部分染色體成分?jǐn)U增，部分染色體成分缺失。這實(shí)際上在基因量變上確定了癌基因的激活和擴(kuò)增，抑癌基因的抑制及缺失。雖然某些機(jī)制尚不完全清楚，本文僅以以下已證實(shí)了的在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制中起重要作用的基因變化，探討染色體改變、基因變異及腫瘤發(fā)生的辯證關(guān)系。

c-myc癌基因定位于染色體8q24帶?；騝-myc編碼的轉(zhuǎn)錄因子通過與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子內(nèi)特異DNA序列結(jié)合而促進(jìn)其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化。同時(shí)研究證明c-myc蛋白又可作用于端粒逆轉(zhuǎn)錄酶，促進(jìn)其表達(dá)并增強(qiáng)其酶的活性，間接抑制細(xì)胞的衰老及死亡[4]。染色體8q增多，導(dǎo)致c-myc基因的擴(kuò)增及其所編碼蛋白的過度表達(dá)，這對(duì)腫瘤的形成具有重要作用。大量研究報(bào)道8q增多/c-myc基因的擴(kuò)增與頭頸部惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有明顯正相關(guān)性。

Hsr(均染區(qū))作為染色體內(nèi)基因擴(kuò)增的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志在本研究中多次出現(xiàn)，并且經(jīng)常定位于11q13。以往頭頸部腫瘤熒光原位雜交研究證實(shí)，許多非定位于11q13的hsr的基因序列來源于染色體11q13帶[5]。癌基因CCND1定位于11q13，CCND1作為一細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1期過渡到S期[6]。過度表達(dá)CCND1可導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期的縮短，縮短了基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)錯(cuò)誤DNA序列的修復(fù)時(shí)間，以致未修復(fù)異?；虻闹饾u積累，以及帶有錯(cuò)誤基因細(xì)胞的不斷分裂和擴(kuò)增。

9p染色體片段的丟失是頭頸部磷狀細(xì)胞癌最常見的遺傳學(xué)改變之一。基因P16/CDKN2A定位于9p21-22區(qū)域。CDKN2A基因編碼G1細(xì)胞周期依賴激酶(Cdks)抑制劑，其通過與Cdks蛋白結(jié)合，及抑制pRB(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)蛋白磷酸化，延長(zhǎng)細(xì)胞周期G1期基因檢測(cè)修復(fù)階段，阻止進(jìn)入S期。CDKN2A基因失活必將導(dǎo)致細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)及細(xì)胞增殖的失調(diào)[7]。

3P的缺失是頭頸部磷狀細(xì)胞癌染色體最早期改變之一。已發(fā)現(xiàn)定位于3p的抑癌基因?yàn)镕HIT基因。其基因的變異和蛋白功能的失調(diào)常發(fā)現(xiàn)于早期的頭頸部磷狀細(xì)胞癌和癌前病變的研究中[8,9]。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因——RB基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以及細(xì)胞分化的過程中起關(guān)鍵的作用。該基因定位于染色體的13q。低磷酸化RB蛋白作為其活化形式，與轉(zhuǎn)錄因子E2F家族蛋白結(jié)合，發(fā)揮阻止轉(zhuǎn)錄因子DNA合成和促進(jìn)細(xì)胞分裂的功能。G1晚期，RB蛋白被細(xì)胞周期依賴激酶磷酸化，釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子，促使細(xì)胞進(jìn)入S期[10]。染色體13q丟失、RB基因低表達(dá)與腫瘤的高惡性度和不良預(yù)后密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究中，染色體丟失的機(jī)率明顯高于染色體成分、數(shù)目的增加，這說明抑癌基因的功能失調(diào)在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制中起相對(duì)主要的作用。

另一方面，大量的染色體斷裂點(diǎn)出現(xiàn)在著絲粒區(qū)域是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的一特殊細(xì)胞遺傳學(xué)改變。一種可能的原因是該區(qū)域的基因在染色體斷裂時(shí)所引起的活化或缺失，是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌腫瘤形成的致病因素之一。研究證明，近著絲粒區(qū)域的DNA在CpG島區(qū)的甲基化程度明顯高于其他區(qū)域的DNA。應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮胞甘可引起染色體著絲粒區(qū)域的斷裂，促進(jìn)姐妹染色單體的互換、核內(nèi)復(fù)制及染色體臂的易位[11]。因此，雖然染色體某些部位基因CpG島區(qū)的過度甲基化可以抑制某些抑癌基因的作用，但著絲粒區(qū)域基因的去甲基化又可促進(jìn)染色體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遺傳學(xué)的研究使大家認(rèn)識(shí)到，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌染色體畸變是非任意性的，是有一定規(guī)律可循的。染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)的不斷變異可能造成癌基因擴(kuò)增、活化，抑癌基因的抑制和缺失；這種多基因改變的不斷積累貫穿著腫瘤發(fā)生、發(fā)展的全部過程。對(duì)于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌染色體畸變規(guī)律的研究和認(rèn)識(shí)，將對(duì)頭頸部腫瘤的診斷、預(yù)后，以及指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。

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