方偉,徐瑞宏,廖萬清

第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院皮膚科,上海200003

新生隱球菌(Cryptococcusneoformans,Cn)是臨床上重要的病原真菌,易侵犯免疫功能低下者,偶見于免疫功能正常的人群。研究證明,10%～40%的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)相關性死亡由隱球菌性腦膜腦炎導致[1]。近年來,隨著器官移植手術的廣泛開展,Cn感染率明顯上升,并發(fā)隱球菌性腦膜腦炎的器官移植患者病死率可高達50%[2]。

樹突細胞(dendritic cell,DC)是人體內(nèi)最重要的抗原呈遞細胞,可有效刺激T細胞和B細胞應答,將固有免疫和適應性免疫有機聯(lián)系起來,是基礎與臨床研究的熱點。盡管DC在啟動宿主免疫方面具有重要的功能,但對其與Cn的相互作用及機制還知之甚少,本文分別從DC和Cn 2個角度論述兩者之間復雜的作用機制。

1 DC在抗Cn感染中的免疫效應

1.1 概述

宿主抗Cn感染的功能主要由細胞免疫介導,Cn感染后的轉(zhuǎn)歸很大程度上取決于Th1/Th2細胞因子的平衡:極化的Th1免疫應答起保護作用,而Th2細胞因子的偏移則使宿主易于感染。這種平衡狀態(tài)在Cn入侵宿主的早期,受到多種免疫細胞的調(diào)節(jié),其中最主要的是DC(圖1)。DC不僅具有強大的抗原識別能力,還高表達主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類分子和共刺激分子;同時還具有強大的誘導初次免疫應答的獨特功能,在體液和細胞免疫應答中發(fā)揮獨特作用。

圖1DC與Cn的相互作用機制

Fig.1ThemechanismsofinterplaybetweendendriticcellsandC.neoformans

Kelly等[3]研究發(fā)現(xiàn),混合人體血清(pooled human serum,PHS)(含不耐熱補體)和(或)抗莢膜單克隆抗體等調(diào)理素能有效促進DC對Cn的識別及其抗真菌活性;但在超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及甘露醇等存在時,DC的抗Cn效應顯著下降。這說明DC在體外通過氧依賴性和非氧依賴性機制發(fā)揮抗Cn效應,那么宿主體內(nèi)感染時是否能產(chǎn)生類似的防御效應呢？

為了研究DC在宿主體內(nèi)的抗Cn作用,Wozniak等[4]通過小鼠的Cn吸入感染模型證實,宿主體內(nèi)的肺DC具有吞噬Cn和抗原呈遞功能,參與誘導宿主抗隱球菌感染的固有免疫和適應性免疫應答。在此基礎上,他們又通過共聚焦顯微鏡證實Cn在被DC吞噬后被迅速運輸至內(nèi)體(endosome)和溶酶體小室內(nèi)(該過程并不依賴特定調(diào)理素的選擇)。DC溶酶體提取物具有顯著的殺真菌作用,且呈現(xiàn)劑量依賴性[5]。實驗證明,DC既有呈遞抗原,又有直接殺滅隱球菌的作用。

1.2 多種Cn抗原識別機制

近年來,病原體相關分子模式在宿主防御感染性疾病中的重要性已經(jīng)越來越為人們所認識。目前研究的熱點主要集中在模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)中的甘露糖受體(mannose receptor,MR)和Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)。

MR是一種常見的C型凝集素受體,能識別末端甘露糖化分子。人體DC表面存在多種MR[6-8],其中對巨噬細胞MR(macrophage MR,MMR,CD206)和DC-SIGN(CD209)研究較多。這2種受體均能識別并內(nèi)化甘露糖蛋白(mannoprotein,MP;存在于Cn胞壁及莢膜中的一種重要抗原),而且識別過程能被其他甘露糖化配體競爭性抑制[9]。

Levitz等[10]通過體外實驗,比較了小鼠脾DC、脾B細胞和巨噬細胞這3種抗原呈遞細胞在應答Cn MP抗原中的作用,發(fā)現(xiàn)只有DC能有效捕獲并呈遞MP抗原給T細胞,并促進其增殖、活化。應用熒光結合實驗對3種細胞進一步分析,發(fā)現(xiàn)盡管三者均表達MR,但只有DC表面的MR對MP具有高親和力,其中MMR和DC-SIGN在識別、吞噬MP抗原過程中發(fā)揮至關重要的作用。Dan等[11]通過構建野生小鼠和敲除MR小鼠的Cn吸入感染模型,發(fā)現(xiàn)MR敲除的小鼠死亡率更高,生存時間更短,且其肺部Cn負荷量顯著增加。但2組小鼠肺部中的未成熟DC對MP抗原的攝取率相似,這可能是宿主DC表面存在其他C型凝集素受體識別抗原的緣故。感染2周后,野生小鼠外周淋巴結中發(fā)生顯著的MP特異性T細胞增殖反應,而MR敲除小鼠則不明顯。由此推測,無論其他凝集素受體是否發(fā)揮抗原識別作用,MR在啟動MP特異性CD4+T細胞應答中是不可或缺的。

上述研究提示,依賴MR識別的免疫機制確實有利于宿主抵御Cn感染,但是還不足以完全保護宿主免受感染或清除病原體。是否可聯(lián)合其他靶受體以增強MR的保護效應以提高宿主的免疫應答水平,尚有待進一步研究。

在抗Cn感染中,另一類重要的PRR是TLR。TLR表達于多種免疫細胞中,僅識別表達在病原微生物上高度保守的結構基序。對于TLR在識別Cn抗原中的作用尚無定論。

Yauch等[12]通過構建CD14、TLR2、TLR4和MyD88缺陷小鼠的隱球菌感染模型,研究TLR和CD14在活體宿主內(nèi)抗Cn的作用,發(fā)現(xiàn)TLR2抗Cn感染效應很有限,而MyD88則非常重要。在另一項研究中,Biondo等[13]認為TLR2和MyD88具有抗隱球菌的防御功能,TLR4則無此效應。

Nakamura等[14]通過小鼠實驗提出,TLR2和TLR4對宿主抗Cn的細胞免疫作用十分有限(與Biondo等研究結果不盡相同)。而Cn的DNA能以類似于CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleo-

tide,CpG-ODN)的方式,通過激發(fā)TLR9-MyD88途徑,最終活化DC,誘導其釋放白細胞介素12(interleukin-12,IL-12)p40,表達CD40,從而產(chǎn)生保護效應[15]。這種Cn的DNA活化效應在TLR9敲除小鼠(TLR9-/-)或MyD88敲除小鼠(MyD88-/-)中則完全消失,說明TLR9可能是宿主免疫系統(tǒng)識別真菌病原體的新機制,為研究、設計新的抗隱球菌免疫治療方法提供了新的思路。

除MR和TLR外,研究還發(fā)現(xiàn)IgG Fc段受體Ⅱ(Fcγ receptor Ⅱ,FcγRⅡ)和補體受體(complement receptor,CR)等表面受體對DC識別并呈遞Cn抗原亦發(fā)揮重要作用[16,17]。

1.3 不同DC亞群產(chǎn)生的影響

根據(jù)細胞來源的不同,DC可分為髓樣DC(myeloid DC,MDC)和淋巴樣/漿細胞樣DC(lymphoid DC/plasmacytoid DC,LDC/PDC),在抗Cn感染中各有不同的功能特點。

Bauman等[16]用保護性免疫原CneF-CFA和非保護性免疫原HKC-CFA的小鼠免疫模型檢驗不同DC亞群在抗Cn感染中所誘導的不同免疫效應。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)CneF-CFA作用后,小鼠回流淋巴結總體細胞數(shù)顯著增加,其中MDC、朗格漢斯細胞(Langerhan’s cell, LC)和CD4+T細胞明顯升高,但是LDC∶MDC比例顯著低于HKC-CFA組或CneF-CFA+HKC-CFA組;而經(jīng)HKC-CFA免疫后,總體細胞數(shù)、CD4+T細胞無明顯增加,LDC卻顯著增加。這可能是因為MDC和LDC作為刺激T細胞活化的主要抗原呈遞細胞,參與抗Cn的保護性細胞免疫應答;而LDC具有負性免疫調(diào)節(jié)作用,其高水平表達與抗Cn的非保護性免疫應答相關;同時,LDC∶MDC的平衡受抗原調(diào)控,從而決定宿主是否能誘導保護性的免疫效應(圖1)。

另有學者[18]通過體外實驗,進一步證實MDC經(jīng)Cn刺激后活化,增強IL-12/23 p40(均為IL-12家族成員,能誘導初始T細胞分化為Th1細胞,對抗Cn,具有保護效應)的分泌,并上調(diào)MHCⅡ類分子和CD86的表達,從而呈遞抗原,刺激T細胞增殖、活化,誘導保護性免疫應答;而LDC無此作用。MDC是否能在活體隱球菌感染過程中也發(fā)揮類似保護功能,尚有待進一步研究。

1.4 DC的成熟狀態(tài)對免疫應答的影響

DC呈遞抗原能力隨其發(fā)育成熟而逐步增強,而攝取抗原能力則逐漸減弱;成熟DC能有效進行抗原呈遞并誘導T細胞活化,而未成熟DC可能誘導免疫耐受。

Herring等[19]研究了DC成熟狀態(tài)對宿主抗Cn感染的影響,發(fā)現(xiàn)在給小鼠接種Cn前輸入經(jīng)Cn MP脈沖處理的未成熟DC,小鼠肺部IL-4、IL-5、IL-10以及嗜酸性粒細胞水平明顯升高,清除病原菌的能力顯著下降〔與經(jīng)抗腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)抗體處理后的效果相似〕。結果提示,未成熟DC抑制抗Cn的保護性Th1免疫應答,誘導Th2免疫偏移(圖1)。

TNF-α能促進未成熟的DC成熟,并從外周組織遷移至回流淋巴結中。TNF-α的拮抗可能通過影響未成熟DC的成熟過程誘導免疫耐受,這很可能是免疫正常宿主發(fā)生慢性Cn感染的一種新機制。因為外傷、繼發(fā)感染、免疫治療等多種因素可使正常宿主發(fā)生早期TNF-α分泌延遲,或?qū)е翫C處于未成熟狀態(tài),從而發(fā)生免疫偏移現(xiàn)象。Osterholzer等[20]在研究Cn尿素酶對宿主清除肺部病原菌能力和免疫應答的差異時,獲得類似結論。

2 Cn對DC的影響

2.1 MP

MP是一類包含80%～90%甘露糖的糖結合蛋白,主要表達于真菌表面,在真菌生長期間脫落[21]。MP是Cn細胞壁中含量最高的一類多糖物質(zhì),在胞壁外莢膜中亦少量存在[22]。

大量的體內(nèi)、外實驗研究證實,MP對于誘導宿主抗真菌的T細胞免疫應答十分重要,不僅能誘導產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應,刺激淋巴細胞增殖,還可誘導人單核細胞早期分泌大量IL-12,對宿主抗Cn感染具有顯著的保護效應,已被鑒定為其所產(chǎn)生的主要免疫顯性抗原[23-26]。

MP具有廣泛的N-甘露糖殘基和O-甘露糖殘基,是DC表面MR和DC-SIGN的配體。Pietrella等[27]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)Cn的MP刺激后,DC表面CD40,CD86,CD83和MHCⅠ、Ⅱ類分子等顯著表達,而CD14、CD16、CD32則受抑制,且大量TNF-α和IL-12分泌;與同源T細胞共孵育后,T細胞大量增殖、活化,并以CD4+T細胞為主,還產(chǎn)生大量細胞因子,且隨時間延長,γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)分泌增加而IL-2、IL-10分泌逐漸減少。說明DC通過表面MR識別Cn的MP,實現(xiàn)最優(yōu)化的抗原呈遞過程,促進宿主的保護性免疫應答(圖1),從理論上進一步確立了以MP構建抗真菌疫苗的可行性。

在此基礎上,Pietrella等[28]引入1個新的干預因素——TLR9激動劑CpG(一種可誘導Th1分化途徑免疫偏移的佐劑)。與單用MP相比,MP+CpG顯著增強小鼠MDC和LDC分泌炎癥細胞因子和趨化因子的能力(其中很多細胞因子與Th1分化途徑的免疫應答有關)以及MP特異性CD4+T細胞IL-2的分泌。除CpG外,其他TLR激動劑亦有類似的免疫效應。很明顯,MP與TLR激動劑的協(xié)同作用能激發(fā)更強烈的Th1保護性免疫應答。結果提示,在研究、設計人用抗Cn疫苗時,MP抗原輔以TLR受體激動劑可能是防治隱球菌病的一個新的思路,目前尚需活體實驗進一步研究。

2.2 莢膜多聚糖

多年研究已證實,莢膜是Cn致病的最主要毒力因子,其80%由葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan,GXM)組成。GXM具有抗宿主吞噬、阻礙白細胞遷移、干擾抗原呈遞、抑制抗真菌的遲發(fā)型超敏反應、致細胞因子分泌失調(diào)和使抗體無應答等多種效應[29-33]。

Vecchiarelli等[34]通過體外實驗,比較了Cn莢膜包被株(Cap-Cn)與莢膜缺陷株(Acap-Cn)對DC活化能力的差異。結果顯示,Acap-Cn易被未成熟DC吞噬,且DC更易成熟并活化同源T細胞,而Cap-Cn作用相反。Cap-Cn組加入抗GXM單克隆抗體后,表現(xiàn)與Acap-Cn相似。推測GXM能有效干擾宿主DC的活化和成熟,這也是Cn逃避宿主免疫應答的途徑之一(圖1)。

Lupo等[35]應用微陣列技術分析、研究DC與Cn的相互作用與影響,證實莢膜多聚糖物質(zhì)的存在使DC基因表達發(fā)生顯著變化。在與莢膜缺陷株(cap59缺陷株)相作用的DC中,大量與促DC成熟及與抗原加工、呈遞功能相關的基因表達上調(diào)。相反,經(jīng)來源于同一遺傳背景的Cn莢膜包被株刺激后,DC中不僅上述基因無顯著表達,而且大量的趨化因子編碼基因表達下調(diào),并誘導IFN-γ和IL-12相關調(diào)節(jié)基因表達。該研究第1次從分子水平證明Cn莢膜逃避宿主免疫的復雜基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡:抑制DC的活化、成熟,阻礙參與抗Cn感染的細胞因子、趨化因子表達以及炎癥反應的發(fā)生。

2.3 尿素酶

除了莢膜,尿素酶也是Cn的重要毒力因子。尿素酶能催化水解尿素生成氨和氨基甲酸鹽,使局部環(huán)境pH升高,利于Cn在吞噬溶酶體中生存。有研究證實尿素酶可促進大腦微血管內(nèi)血循環(huán)量上升,從而利于Cn侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng),導致宿主罹患腦膜腦炎,甚至死亡[36]。

Osterholzer等[20]比較尿素酶陽性株與陰性株接種后宿主肺部清除病原體能力和免疫應答的差異,結果發(fā)現(xiàn),與陰性株相比,經(jīng)尿素酶陽性株感染后,小鼠肺部清除病原體能力明顯受損,并啟動了非保護性免疫應答——Th2分化途徑的免疫,而且在肺部和回流的淋巴結中發(fā)現(xiàn)大量未成熟的DC(如前所述,大量未成熟DC促進Th2分化途徑的免疫偏移,圖1)。

很多研究已經(jīng)證明,宿主清除Cn以預防其播散性感染的關鍵在于誘導Th1分化途徑的免疫應答,而Th2免疫應答對抵御Cn的肺部感染無保護作用,而且可能與Cn的持續(xù)性感染有關[37-40]。另一種產(chǎn)尿素酶的病原體牛分枝桿菌(M.bovis)的相關研究也證實,尿素酶的存在強烈促進了Th2途徑的適應性免疫應答[41]。

3 結語

隨著HIV在世界范圍內(nèi)的蔓延、免疫抑制劑以及創(chuàng)傷性治療手段的廣泛應用,全球易感人群日益增多,Cn等侵襲性真菌感染的發(fā)病率明顯上升。DC在宿主抵抗真菌侵襲性感染中具有十分獨特且極其重要的免疫作用,免疫學防治策略已成為預防和輔助治療隱球菌病的新的選擇方向。抑制隱球菌毒性因子和促進DC成熟等方法可能會有助于提高侵襲性真菌感染防治疫苗或新的治療方法的效果。

迄今,對Cn與DC的相互作用關系知之甚少,如果能進一步洞察兩者之間的復雜作用機制,對深入理解Cn的致病機制、探索和建立新的控制Cn感染的免疫治療方法無疑具有非常重要的意義。

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