甘霖,王明麗,陳敬賢,2

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室,合肥230032； 2. 美國哥倫比亞大學(xué)病理與細胞生物學(xué)系,紐約10032

水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)屬皰疹病毒α亞科,其原發(fā)感染為水痘,潛伏感染再激活時可引發(fā)帶狀皰疹。對于具有正常免疫能力的兒童,水痘是一種良性、自限性過程;但對于免疫功能低下者,水痘則是一種嚴重、甚至致命的疾病。接受腫瘤化療、放療的兒童感染水痘病毒后,約30%會產(chǎn)生進行性、全身性水痘,病死率為7%～28%[1]。孕婦若在分娩前5 d和產(chǎn)后48 h之間罹患水痘,可能引起圍生期水痘,嬰兒病死率高達30%[2]。成人罹患水痘并不常見,但發(fā)病時常伴比較嚴重的全身癥狀。

自從1995年美國食品與藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)Oka水痘減毒活疫苗用于預(yù)防水痘以來,世界上多個國家相繼開始使用該疫苗。我國從1998年開始引進該疫苗,用于12個月以上的VZV易感個體以預(yù)防水痘。目前我國市場上有4個廠家的疫苗,包括Merck公司的VariVax?、葛蘭素史克公司的VarilRix?以及上海生物制品研究所和長春百克生物科技有限公司生產(chǎn)的凍干水痘減毒活疫苗。后2所廠家所使用的毒株均為日本Biken研究院的Oka減毒株。近年來,研究發(fā)現(xiàn)接種水痘疫苗后病毒可潛伏在接種者的感覺神經(jīng)節(jié)中,并能被再次激活而引發(fā)帶狀皰疹[3,4],患者與易感個體接觸后還可引起水痘[5,6]。因此在廣泛使用減毒活疫苗的同時,有必要追蹤水痘和帶狀皰疹病例中是否有疫苗株病毒感染致病的可能。

VZV只有1個血清型,基因組具有較好的穩(wěn)定性,基因變異主要表現(xiàn)為單個核苷酸的變化。通過比對疫苗(v-Oka)與其親本毒株(p-Oka)的全基因,發(fā)現(xiàn)42個核苷酸發(fā)生了突變,這些變異可以通過限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)和測序分析來檢測。

本研究中,我們從水痘患者水皰液中分離到VZV,并對分離到的毒株開放讀碼框架(open reading frame,ORF)1、6、21、31、45、51和62進行測序分析,證實為疫苗株的VZV。

1 材料和方法

1.1 病例資料

患者為23歲女性,幼兒園教師,因患水痘于2008年4月前往安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科就診。體溫37.8 ℃,次日其軀干出現(xiàn)50個以上散在分布的皮膚水皰疹,未出現(xiàn)并發(fā)癥?；颊呒捌涓改妇鶝]有水痘史和疫苗接種史。發(fā)病17 d前,患者與其班級1名患帶狀皰疹的5歲男孩發(fā)生直接接觸?；仡櫺哉{(diào)查顯示,該男孩于2007年2月曾接種1人份某公司水痘疫苗,接種后接種部位皮膚出現(xiàn)1 cm左右的紅斑,幾天后消失。13個月后(2008年3月)男孩疫苗接種部位出現(xiàn)帶狀皰疹樣的皮膚水皰疹。沒有證據(jù)顯示男孩和女教師有免疫缺陷。

1.2 細胞和病毒

人胚肺成纖維細胞(human embryonic lung fibroblast,HELF)為本室保存。日本Oka疫苗親本株(p-Oka)和VZV美國野毒株(MLS)由美國哥倫比亞大學(xué)Anne A. Gershon教授惠贈;China-18和China-38為本室以前分離的VZV野毒株;VZV減毒活疫苗購自上海生物制品研究所(批號:2007120401)。

1.3 病毒分離與鑒定

病毒分離與鑒定參照文獻進行[8]。在皮膚水皰疹出現(xiàn)3 d時,用1 ml注射器吸取皮膚水皰液,取10 μl接種至長成單層的HELF細胞,置5% CO2、37 ℃孵箱培養(yǎng),每天觀察細胞病變(cytopathic effect,CPE);待出現(xiàn)特征性CPE后,取少量細胞涂片,應(yīng)用VZV糖蛋白gE單克隆抗體(Biodesign International?,Maine,USA),經(jīng)間接免疫熒光染色予以鑒定。

1.4 血清中VZV特異性IgG檢測

血清標(biāo)本分別在第3和14天采集,并通過膜免疫熒光抗體(fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA)法檢測血清中VZV特異性IgG效價。方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)由美國哥倫比亞大學(xué)Anne A. Gershon教授提供[9]。

1.5 DNA提取和序列分析

用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extrac-tion Kit Ver.3.0試劑盒(大連寶生物工程有限公司)分別提取患者水皰液和體外培養(yǎng)HELF細胞中的病毒DNA。自患者水皰液提取的病毒DNA記為Vesicular DNA,自病變HELF細胞提取的病毒DNA記為Culture DNA。用同樣方法從培養(yǎng)細胞中提取p-Oka、MLS、China-18、China-38的DNA和未感染VZV的HELF DNA(作為對照),上海生產(chǎn)的水痘疫苗DNA從未經(jīng)分離培養(yǎng)的減毒活疫苗中直接提取。所有提取的DNA,經(jīng)紫外分光光度法確定濃度后置-20 ℃保存。

采用文獻[10]中的引物擴增VZV ORF 1、6、31、38、51、54和62,聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒(大連寶生物工程有限公司)回收后,送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果用Mage 4.02軟件進行比對分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離與鑒定

單層HELF細胞在皮膚水皰液標(biāo)本接種后第3天開始出現(xiàn)典型的局灶性CPE(圖1 A),取少量呈現(xiàn)CPE的細胞涂片,固定后用VZV特異性gE抗體進行間接免疫熒光染色,陽性者呈現(xiàn)很強的胞質(zhì)著色(圖1 B)。

A: Focal cytopathic changes of VZV were observed 3 days following inoculation of virus into human embryonic fibroblasts (×100). B: Detection of VZV-specific antigens by indirect immunofluorescence using monoclonal antibodies against VZV glycoprotein E (×400). Nuclei staining by DAPI (blue). VZV gE detected by FITC-conjugated secondary antibody (green).

圖1病毒分離和間接免疫熒光鑒定結(jié)果

Fig.1Theresultsofvirusisolationandindirectimmunofluorescence

2.2 血清中VZV特異性IgG效價

FAMA實驗結(jié)果顯示,第3天患者血清中VZV特異性IgG效價為1∶4,第14天上升至1∶128,升高4倍以上。

2.3 序列分析

測序結(jié)果經(jīng)Mage 4.02軟件比對發(fā)現(xiàn),直接從患者皮膚水皰液標(biāo)本獲得的病毒DNA與從分離培養(yǎng)獲得的病毒DNA序列完全一致,且不同于野毒株,而與Oka疫苗株的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點相同(圖2)。核苷酸位置參照VZV Dumas株(GenBank 登錄號:X04370),vOka為日本Biken研究院疫苗株的VZV(GenBank登錄號:AB097932),VariVax為Merck公司生產(chǎn)的水痘疫苗(GenBank登錄號:DQ008355),VarilRix為葛蘭素史克公司生產(chǎn)的水痘疫苗(GenBank登錄號:DQ008354)。

R, allelic mix (purine); Y, allelic mix (purimidine); vOka/Shanghai, vaccine manufactured in Shanghai.

圖2測序后對疫苗相關(guān)單核苷酸多態(tài)性位點的比對分析

Fig.2Vaccinestrain-associatedsinglenucleotidepolymorphismsoftheisolatedviruses:analysisbetweenwildtypestrainsandvaccinestrains

3 討論

水痘疫苗是通過減毒作用獲得的,盡管迄今對Oka疫苗減毒的分子機制尚未闡明,但比對v-Oka與p-Oka的全基因,發(fā)現(xiàn)42個核苷酸發(fā)生突變,其中超過1/3(15/42)的突變發(fā)生在ORF 62中[7]。另外,通過減毒作用的疫苗株病毒并不是單個克隆,而是由多株基因差別很小的病毒形成的混合物,這使得不同廠家生產(chǎn)的疫苗基因也存在差異,但是它們預(yù)防水痘的效果并沒有明顯不同[7]。正是不同疫苗基因之間存在差異,使得我們更容易追蹤病毒的來源及研究疫苗的應(yīng)用是否對VZV的分子流行病學(xué)特征產(chǎn)生影響。

疫苗株VZV引起疾病并不罕見,但主要是以接種者出現(xiàn)帶狀皰疹為主,且癥狀均較輕[3-6]。疫苗株病毒傳播到易感個體所引起水痘的病例較為罕見[11-13]。目前報道的病例具有共同的特征:①在家庭成員之間傳播,如子女接種疫苗后,會使對VZV沒有免疫力的父母罹患水痘;②兒童接種疫苗通常會在接種部位出現(xiàn)水皰或紅斑等皮膚反應(yīng);③被傳染者的水痘癥狀較輕。

當(dāng)確認分離到的毒株為疫苗株后,我們對患者病史進行了調(diào)查。該患者曾與接種過某公司水痘疫苗后發(fā)生帶狀皰疹的男孩直接接觸,從患者分離到的VZV在基因特征上更接近于該公司水痘疫苗,提示這可能是水痘疫苗發(fā)生二次傳播(secondary transmission)的病例。與國外相關(guān)報道不同的是,本研究中二次傳播發(fā)生在公共場所,而不是在家庭內(nèi)部。

本研究提示,水痘疫苗株病毒二次傳播不僅存在于家庭成員之間,還可出現(xiàn)在其他人員密切接觸的地方,如學(xué)校等。因而有必要檢測學(xué)校、醫(yī)院等機構(gòu)剛成年的工作人員是否對VZV有免疫力,對易感個體應(yīng)盡早接種疫苗,以防成人水痘的發(fā)生。

[1] Feldman S, Lott L. Varicella in children with cancer: impact of antiviral therapy and prophylaxis [J]. Pediatrics, 1987, 80(4): 465-472.

[2] Enders G, Miller E, Cradock-Watson J, Bolley I, Ridehalgh M. Consequences of varicella and herpes zoster in pregnancy prospective study of 1 739 cases [J]. Lancet, 1994, 343(8912): 1548-1551.

[3] Uebe B, Sauerbrei A, Burdach S, Horneff G. Herpes zoster by reactivated vaccine varicella-zoster virus in a healthy child [J]. Eur J Pediatr, 2002, 161(8): 442-444.

[4] Hambleton S, Steinberg SP, Larussa PS, Shapiro ED, Gershon AA. Risk of herpes zoster in adults immunized with varicella vaccine [J]. J Infect Dis, 2008, 197(Suppl 2): S196- S199.

[5] Chaves SS, Haber P, Walton K, Wise RP, Izurieta HS, Schmid DS, Seward JF. Safety of varicella vaccine after licensure in the United States: Experience from reports to the vaccine adverse event reporting system, 1995-2005 [J]. J Infect Dis, 2008, 197(Suppl 2): S170-S177.

[6] Galea SA, Sweet A, Beninger P, Steinberg SP, Larussa PS, Gershon AA, Sharrar RG. The safety profile of varicella vaccine: a 10-year review [J]. J Infect Dis, 2008, 197(Suppl 2): S165-S169.

[7] Gomi Y, Sunamachi H, Mori Y, Nagaike K, Takahashi M, Yamanishi K. Comparison of the complete DNA sequences of the Oka varicella vaccine and its parental virus [J]. J Virol, 2002, 76(22): 11447-11459.

[8] 陳敬賢.診斷病毒學(xué)[M].人民衛(wèi)生出版社,2008,244-251.

[9] Gershon A, Chen J, LaRussa P, Steinberg S. Manual of Clinical Microbiology [M]. 9th ed. Washington, DC: ASM Press, 2007.

[10] Wagenaar TR, Grose C, Loparev VN, Schmid DS, Breuer J. Genomic analysis of varicella-zoster virus: primers for individual open reading frames [J]. J Clin Virol, 2003, 28(1): 104-110.

[11] Grossberg R, Harpaz R, Rubtcova E, Loparev V, Seward JF, Schmid DS. Secondary transmission of varicella vaccine virus in a chronic care facility for children [J]. J Pediatr, 2006, 148(6): 842-844.

[12] Salzman MB, Sharrar RG, Steinberg S, LaRussa P. Transmission of varicella-vaccine from a healthy 12-month-old to his pregnant mother [J]. J Pediatr, 1997, 131(1 Pt 1): 151-154.

[13] Brunell P, Argaw T. Chickenpox attributable to a vaccine virus contracted from a vaccinee with zoster [J]. Pediatrics, 2000, 106(2): E28.