楊 杰，張 建，魏岱林，閆曉云，馮永軍，吳平霞

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 泰安 271000)

眾所周知，胰島β細(xì)胞分泌胰島素功能缺陷是決定血糖水平變化的最為重要的病理生理因素之一，是發(fā)生2型糖尿病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。因此，評(píng)估胰島β細(xì)胞功能對(duì)于研究糖尿病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后以及指導(dǎo)制定個(gè)體化的治療方案等均具有十分重要的意義。目前，評(píng)估胰島β細(xì)胞功能的方法眾多，其中，高葡萄糖鉗夾技術(shù)是經(jīng)典和公認(rèn)的方法[1]，它能全面反映胰島β細(xì)胞功能，觀察胰島素雙相分泌功能以及胰島β細(xì)胞功能葡萄糖刺激的敏感性。本試驗(yàn)旨在初步研究高葡萄糖鉗夾技術(shù)的建立。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 12例正常人，男6例，女6例，平均年齡(33±5.8)歲，男女受試者年齡及體重指數(shù)均無(wú)顯著差異，均排除糖尿病、糖耐量減退及肝、腎疾病，均未使用影響胰島素分泌及胰島素敏感性的藥物。試驗(yàn)前3天，受試者每日碳水化合物飲食不少于250 g，試驗(yàn)前，告知受試者試驗(yàn)的性質(zhì)、目的、注意事項(xiàng)及可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)，并填寫(xiě)知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1用品準(zhǔn)備 快速葡萄糖測(cè)定儀(德國(guó)BIOSEN)、輸液泵(法國(guó)OPTIMA PT)、自制恒溫箱、靜脈留置針Y型、直型留置針(德國(guó)貝朗)、肝素帽3個(gè)、消毒液、無(wú)菌紗布、輸液器、透明敷貼、5 ml注射器、1 ml注射器、50 ml注射器、胰島素檢測(cè)試劑盒(泰格科信增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法)、10%和50%葡萄糖、0.9%氯化鈉。

1.2.2所有受試對(duì)象空腹12 h，早晨8:00到實(shí)驗(yàn)室，測(cè)定身高、體重、腰圍及臀圍，并排空小便后仰臥。實(shí)驗(yàn)室要求環(huán)境整潔、溫濕度適宜(溫度25℃、濕度60%)，備好床單元、輸液架、將輸液泵、恒溫箱分別固定在床的兩側(cè)連接好。后配制20%葡萄糖，取10%葡萄糖500 ml一袋，抽出125 ml棄之，加入50%葡萄糖125 ml，同法再配制另一袋。分別在受試者雙前臂靜脈或正中靜脈穿刺并留置穿刺針，以0.9%NaCl液維持通道，以備抽血及輸注20%的葡萄糖。試驗(yàn)過(guò)程要求受試者在清醒安靜狀態(tài)下進(jìn)行，總時(shí)間為3小時(shí)。

1.2.3高葡萄糖鉗夾試驗(yàn) 在試驗(yàn)開(kāi)始前30 min、15 min、0 min分別抽取基礎(chǔ)血樣，并將一側(cè)前臂置于恒溫儀中(溫度50 ℃)以保證靜脈血?jiǎng)用}化。另一側(cè)靜脈開(kāi)始輸注20%葡萄糖，具體輸注速率按照DeFronzo經(jīng)典鉗夾技術(shù)[2]的體表面積經(jīng)驗(yàn)值(表1)和實(shí)際操作中測(cè)定的血糖值來(lái)調(diào)整。高葡萄糖鉗夾的目標(biāo)值是在正?？崭寡堑幕A(chǔ)上通過(guò)輸注葡萄糖使血糖濃度快速升高到13 mmol/L左右，并維持此高糖平臺(tái)2小時(shí)以上。葡萄糖的輸注可分為2個(gè)階段[2]：(1)初始劑量期，又稱(chēng)血糖快速升高階段，為鉗夾試驗(yàn)開(kāi)始至第14分鐘，此期內(nèi)血糖快速升至目標(biāo)值。每2 min取血測(cè)血糖(葡萄糖氧化酶法，德國(guó)內(nèi)卡公司的快速血糖檢測(cè)儀)，0～10 min每2 min取血分離血清待測(cè)胰島素。(2)維持劑量期，又稱(chēng)高糖平臺(tái)維持階段，為鉗夾試驗(yàn)15～150 min，此期需將血糖穩(wěn)定在目標(biāo)值左右。期間每5 min取血測(cè)血糖，并根據(jù)血糖值調(diào)節(jié)葡萄糖輸注率。每10 min取血分離血清待測(cè)胰島素。所有血樣置于-80℃冰箱保存至測(cè)定。

1.2.4收集試驗(yàn)期間的尿標(biāo)本，測(cè)定尿糖濃度，以校正葡萄糖代謝率。

1.3計(jì)算方法和指標(biāo)

1.3.1雙相胰島素(Ins)分泌 (1)第1時(shí)相Ins分泌(1Ph)：為高糖鉗夾試驗(yàn)前10 min，即2、4、6、8、10 min的Ins濃度的總和[3]。(2)第2時(shí)相Ins分泌(2Ph)：為高糖鉗夾中20～150 min的平均Ins濃度。

1.3.2最大Ins分泌量 為鉗夾試驗(yàn)中最后的30 min(即120～150 min)的平均Ins濃度。

1.3.3葡萄糖代謝率(M，mg·kg-1·min-1)鉗夾過(guò)程中葡萄糖輸注率(INF)減去空間校正值(SC)和尿糖值(UC)，即M=INF-SC-UC ，SC=(G2-G1)×0.095×18，其中G2、G1分別表示調(diào)整后及前的血糖值(mmol/L)。

1.3.4Ins敏感性指數(shù)(ISI) 為鉗夾試驗(yàn)中最后30 min(即120～150 min)的平均葡萄糖代謝率(M)與平均胰島素濃度(I)的比值×100，即ISI=M/I×100[2]。

表1 高葡萄糖鉗夾0～14 min葡萄糖輸注率

2 結(jié) 果

2.1高葡萄糖鉗夾技術(shù)的建立

2.1.1高糖平臺(tái)的建立 血漿葡萄糖水平基礎(chǔ)狀態(tài)為(5.06±0.08) mmol/L，高糖鉗夾開(kāi)始后血糖快速升高，平均在第8分鐘達(dá)到高糖目標(biāo)水平，即(13.16±0.28) mmol/L。在以后的鉗夾過(guò)程中，血糖持續(xù)穩(wěn)定在此高糖平臺(tái)，平均為(12.95±0.15) mmol/L。在整個(gè)過(guò)程中，血糖變化相對(duì)較小，變異系數(shù)為4.6%(圖1)。

2.1.2Ins的雙相分泌與最大Ins分泌量 (1)1Ph：鉗夾開(kāi)始前，基礎(chǔ)Ins值平均為(6.56±0.98) mU/L，高葡萄糖鉗夾開(kāi)始后，血胰島素濃度迅速升高，在4～8 min出現(xiàn)第一個(gè)峰值，達(dá)(73.82±5.63) mU/L，隨后漸下降，20～30 min最低，為(48.63±3.91) mU/L，1Ph為(256±17.89) mU/L。(2)2Ph：20～150 min平均Ins濃度為(90.52±7.1) mU/L。(3)最大Ins分泌量，即鉗夾120～150 min的平均Ins濃度為(116.27±11.34) mU/L。

2.1.3葡萄糖代謝率和ISI 鉗夾開(kāi)始后葡萄糖輸注率從最大速率在14 min內(nèi)逐漸下降，在20～30 min最低，后葡萄糖輸注率緩慢平穩(wěn)升高，至120～150 min平穩(wěn)，波動(dòng)較小。由計(jì)算所得M120～150 min平均為(16.3±0.12) mg·kg-1·min-1。鉗夾過(guò)程中尿糖平均值為(0.29±0.05) mg·kg-1·min-1。ISI為(16.25±2.02 )mg·kg-1·min-1/mU/L。

圖1 高葡萄糖鉗夾血漿葡萄糖曲線

圖2 高葡萄糖鉗夾血漿胰島素水平

3 討 論

胰島β細(xì)胞功能非常復(fù)雜，包括胰島β細(xì)胞感知胰島素分泌的能力、胰島素合成和分泌以及β細(xì)胞分化、增殖、凋亡及再生等。目前，胰島β細(xì)胞功能有狹義和廣義之分。狹義定義指β細(xì)胞在葡萄糖刺激下分泌胰島素以維持血糖水平穩(wěn)定的功能，可用于評(píng)定與藥物治療無(wú)關(guān)的β 細(xì)胞胰島素分泌功能。廣義定義則指β細(xì)胞在葡萄糖及非葡萄糖因素(精氨酸、胰高血糖素、化學(xué)藥物等)刺激下分泌胰島素來(lái)維持血糖水平穩(wěn)定的能力，用于評(píng)定與藥物治療有關(guān)的β 細(xì)胞胰島素分泌功能，例如改善胰島素敏感性，刺激胰島素的分泌，糾正高血糖的毒性等是否引起β細(xì)胞功能變化及變化的機(jī)制[4]。

目前，評(píng)估胰島β細(xì)胞功能比較困難，存在許多矛盾和爭(zhēng)論，因此，臨床和科研中有很多方法評(píng)估胰島β細(xì)胞功能，包括胰島素脈沖樣分泌模式的檢測(cè)和胰島β細(xì)胞分泌刺激試驗(yàn)(葡萄糖刺激試驗(yàn)和非葡萄糖刺激試驗(yàn))。葡萄糖刺激試驗(yàn)主要有高葡萄糖鉗夾技術(shù)、正葡萄糖高胰島素鉗夾技術(shù)、靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)(IVGTT)結(jié)合數(shù)學(xué)模型分析技術(shù)以及臨床常用的口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT)等；非糖刺激試驗(yàn)主要有精氨酸試驗(yàn)及胰高血糖素試驗(yàn)。

其中，高葡萄糖鉗夾技術(shù)是經(jīng)典和公認(rèn)的精確性最高的評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞功能的方法。該方法是由Rubin Andres首先建立，DeFronzo繼而應(yīng)用于人類(lèi)胰島β細(xì)胞功能評(píng)估的。其原理是通過(guò)持續(xù)輸注外源性葡萄糖，將血糖控制在高糖目標(biāo)值，觀察β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的反應(yīng),從而評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞功能。在持續(xù)的高糖刺激下，Ins的分泌呈現(xiàn)雙相峰。第1時(shí)相指輸入葡萄糖10 min內(nèi)，Ins的分泌快速上升，峰值多在4～8 min。在葡萄糖的刺激下，β細(xì)胞內(nèi)β顆粒迅速釋放胰島素，使短期內(nèi)達(dá)到峰值，主要反映β細(xì)胞的儲(chǔ)備功能。隨后外源性葡萄糖持續(xù)輸注使血糖維持在較高水平，故β細(xì)胞繼續(xù)合成和分泌Ins，第2時(shí)相分泌逐漸明顯，此相Ins濃度升高相對(duì)緩慢，且與高糖持續(xù)時(shí)間保持一致。由于高糖鉗夾使不同個(gè)體血糖升高的水平相同，且可完整地觀察Ins的雙相分泌，故能精確地評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞儲(chǔ)備和分泌功能。

成功建立高葡萄糖鉗夾技術(shù)需符合下列要求[5]：(1)在指定時(shí)間內(nèi)(14 min)形成機(jī)體高葡萄糖狀態(tài)并維持試驗(yàn)所需的高糖平臺(tái)；(2)在維持高糖平臺(tái)期間，每5 min檢測(cè)一次血糖，其變異系數(shù)不能超過(guò)5%；(3)出現(xiàn)雙相Ins分泌形態(tài)。

本研究嚴(yán)格按照DeFronzo的經(jīng)典技術(shù)進(jìn)行。觀察結(jié)果如下：(1)高糖鉗夾開(kāi)始后血糖快速升高，平均在第8 min達(dá)到高糖目標(biāo)水平，即(13.16±0.28) mmol/L。血糖持續(xù)穩(wěn)定在此高糖平臺(tái)，平均為(12.95±0.15) mmol/L。(2)鉗夾過(guò)程中每5 min測(cè)血糖，變異系數(shù)為4.6%。(3)高葡萄糖鉗夾開(kāi)始后，血胰島素濃度迅速升高，在4～8 min出現(xiàn)第一個(gè)峰值，達(dá)(73.82±5.63) mU/L，1Ph為(256±17.89) mU/L，2Ph為(90.52±7.1) mU/L，最大Ins分泌量為(116.27±11.34) mU/L。上述結(jié)果提示高葡萄糖鉗夾技術(shù)已經(jīng)成功建立，在高糖刺激下，能夠真實(shí)反映胰島素一相和二相分泌，了解胰島β細(xì)胞儲(chǔ)備和分泌功能，評(píng)估β細(xì)胞功能。

通過(guò)建立高葡萄糖鉗夾技術(shù)，略談幾點(diǎn)體會(huì)和注意事項(xiàng)：(1)一定嚴(yán)格篩選正常受試者，排除如肥胖、血尿酸增高等可能影響胰島素雙相分泌的因素。(2)由于本試驗(yàn)需持續(xù)2小時(shí)以上，試驗(yàn)過(guò)程中受試者出現(xiàn)排尿等可能影響血糖波動(dòng)的因素，注意及時(shí)調(diào)整胰島素輸注率，避免血糖過(guò)度波動(dòng)。(3)恒溫箱調(diào)節(jié)溫度為50℃，使靜脈血?jiǎng)用}化，避免溫度過(guò)高或過(guò)低，影響結(jié)果。(4)由于每例受試者需要采血37次，前14 min每2 min采血一次，故采血時(shí)既要嚴(yán)格無(wú)菌操作，準(zhǔn)確及時(shí)，又要防止溶血等可能影響結(jié)果的因素。(5)高糖持續(xù)刺激至150 min試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，體內(nèi)血胰島素濃度仍然保持在較高水平，此時(shí)，停止高葡萄糖輸注，受試者在停止輸注約半小時(shí)后會(huì)出現(xiàn)低血糖癥狀，為避免發(fā)生，應(yīng)告知受試者試驗(yàn)結(jié)束時(shí)立即進(jìn)食。

綜上所述，高葡萄糖鉗夾技術(shù)能了解Ins的雙相分泌，能發(fā)現(xiàn)早期及潛在的β細(xì)胞功能減退，能獲得β細(xì)胞最大的胰島素分泌量[6]。本研究成功建立正常受試者高葡萄糖鉗夾技術(shù)，為下一步研究更廣泛人群的β細(xì)胞功能，如長(zhǎng)期大量飲酒者、肥胖者、IGT、糖尿病患者提供了技術(shù)保障和支持[7]。

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