趙立紅

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 泰安 271000 )

風(fēng)疹病毒主要侵犯上呼吸道粘膜，引起上呼吸道炎癥。風(fēng)疹病毒感染最嚴(yán)重的問題是孕婦感染可導(dǎo)致對嬰兒的先天性損害，尤其前3個月感染風(fēng)疹病毒，可通過胎盤感染胎兒，導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)、死胎，或新生兒一系列的器官畸形等先天性風(fēng)疹綜合癥(congenital rubella syndrome，CRS)[1]。為了盡早檢測臨床標(biāo)本中風(fēng)疹病毒，避免出生缺陷，本研究建立了風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時熒光定量RT-PCR(real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)方法，并構(gòu)建了RV實(shí)時熒光定量RT-PCR參考標(biāo)準(zhǔn)，為臨床應(yīng)用中風(fēng)疹診斷提供簡便、快捷、準(zhǔn)確、定量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1病毒株、質(zhì)粒、試劑與儀器 風(fēng)疹病毒疫苗RA27/3株購自泰安市疾控中心。質(zhì)粒pET30a(+)由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所趙蔚明教授惠贈。Taq DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶AMV-RT購自Takara公司。UNIQ-10柱式總RNA抽提純化試劑盒、SK1191 UNIQ-10柱離心式質(zhì)粒DNA小抽試劑盒均購自上海生物工程有限公司。E.Z.N.A. DNA凝膠回收試劑盒購自美國Omega公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。T-1型熱循環(huán)儀為德國Biometra公司產(chǎn)品。尤尼柯紫外可見分光光度計為上海尤尼柯儀器有限公司。PE7300實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增分析儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.2定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.2.1風(fēng)疹病毒疫苗RA27/3株RNA的制備及cDNA合成 UNIQ-10柱式總RNA抽提純化試劑盒提取風(fēng)疹病毒疫苗RA27/3株中RV RNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。0.5 ml反應(yīng)管中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積為20 μl，包含 4.0 μl RT buffer (5×)，1.0 μl AMV RTase(5 U/μl)×L，4.0 μl dNTPs (2.5 mM)，0.5 μl RNase inhibitor (40 U/μl)，1.0 μl Random 9 Primer (50 pmol/μl)，5.0 μl RV RNA 模板，4.5 μl DEPC 雙蒸水。將混合物振蕩混勻，離心30 s，于PCR儀里按下列條件反應(yīng)運(yùn)行，30℃10 min，42℃60 min，99℃5 min，5℃ 5 min，合成RV cDNA。

1.2.2RV基因特異性PCR擴(kuò)增子作為參考標(biāo)準(zhǔn)品 根據(jù)RV RA27/3基因序列(GeneBank no. X14871.1)，引物設(shè)計、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[2]。上游引物：5′-ATGCGTCCGCTTTGAGTC -3′，下游引物：5′-TATGTCCGTGCGGCGTGTTAG-3′，引物序列由上海博亞有限公司合成；以合成的RV RA27/3 cDNA為模板按下列反應(yīng)體系和條件擴(kuò)增目的片斷；50 μl反應(yīng)體系中：上下游引物各1.0 μl(25 μM)，Ex-Taq DNA聚合酶(5 U/μl) 0.5 μl， 10×LA PCR Buffer II (Mg2+Free) 5 μl，MgCl2(25 mM) 5 μl， 四種dNTP混合物8 μl(各2.5 mM)，pBluscriptII SK-E1 DNA模板10 μl，三蒸水19.5 μl；反應(yīng)條件：93°C 4 min 預(yù)變性， 93°C 變性45 s，55°C退火1 min，72°C延伸3 min，共35個循環(huán)；最后72°C延伸5 min。然后,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察，切取相應(yīng)的條帶純化回收。

1.2.3RV基因特異性PCR擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)品的定量及純度測定 取10 μl純化的PCR RV cDNA 樣品稀釋到500 μl，采用紫外分光光度計法測定OD260nm，換算成樣品的拷貝濃度，重復(fù)三次取平均值，以確定該標(biāo)準(zhǔn)品的濃度；測定OD260nm/OD280nm分析其純度。將確定濃度及純度的RV PCR擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行一系列整倍數(shù)稀釋，-70℃保存，用作后繼研究中RV實(shí)時熒光定量RT-PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3RV 實(shí)時熒光定量RT-PCR 上、下游引物采用上述制備RV基因特異性PCR擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)品的引物，TaqMan 探針設(shè)計，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[2]，TaqMan 探針序列：5′-GATTGTGGACGGCGGCT-3′，由上海博亞有限公司合成。優(yōu)化的50μl PCR 反應(yīng)體系中，包含10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free)緩沖液5 μl，上下游引物各1.0 μl(25 μM)，TaqMan熒光探針1.0 μl(25 μM)，Ex-Taq 聚合酶(5 U/μl ) 0.5 μl，MgCl2(25 mM) 5 μl，4 種dNTP 混合物8 μl(各2.5 mM)，樣本cDNA、107～102不同梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品cDNA模板、陰性對照(三蒸水)及陰性對照DNA(質(zhì)粒pET30a(+))各10 μl。優(yōu)化的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性45 s，57℃退火1 min，72℃延伸30 s，先做10個循環(huán)，最后94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，做30個循環(huán)。于PE7300全自動PCR擴(kuò)增分析儀上進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 直線回歸與相關(guān)應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1定量陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備及定量 RV基因特異性PCR擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)品為RVE1高度保守區(qū)一段503 bp的序列(圖1)。紫外分光光度計法定量該特異性PCR RV cDNA標(biāo)準(zhǔn)品，測OD260nm，OD值為0.014，然后算出該RV cDNA的質(zhì)量濃度為2.75×109拷貝/μl。OD260nm/OD280nm為1.95，示該定量標(biāo)準(zhǔn)品具有92%的純度。

圖1 RV基因特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳M: Marker DL2000，1. 陰性對照，2. RV基因片斷PCR 結(jié)果(503 bp)

2.2定量陽性標(biāo)準(zhǔn)動力學(xué)曲線、標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線的建立及回歸方程的設(shè)定 10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品cDNA(2.75×107～2.75×102拷貝/反應(yīng))在PE7300全自動實(shí)時熒光定量PCR儀上擴(kuò)增后，系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，自動生成標(biāo)準(zhǔn)動力學(xué)曲線。系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，通過baseline 的設(shè)定，自動生成標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線是以循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct)為縱坐標(biāo)，以陽性標(biāo)準(zhǔn)模板基因拷貝數(shù)的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)的一條嚴(yán)格的直線型曲線，由標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線可以看出,該標(biāo)準(zhǔn)品不同稀釋度的各個有效反應(yīng)點(diǎn)均落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的相應(yīng)位置上,線性相關(guān)系數(shù)r為-0.9993(r2=0.9986)，P<0.001，表明10倍系列稀釋的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品cDNA的自然對數(shù)值與相應(yīng)的Ct值具有良好的相關(guān)性，證實(shí)了本研究建立的風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時熒光定量RT-PCR方法定量的準(zhǔn)確性。系統(tǒng)運(yùn)行Analysis 過程,生成回歸方程為:y =-3.15x +31.29。

3 討 論

風(fēng)疹是由風(fēng)疹病毒引起的一種全球性傳染病，人群對風(fēng)疹病毒普遍易感，給人類健康帶來極大危害。育齡婦女特別是孕婦早期感染常常具有危及胎兒導(dǎo)致胎兒致畸或死胎以及引起自然流產(chǎn)的危險。為提高出生人口質(zhì)量，降低異常妊娠的發(fā)生率及自然流產(chǎn)次數(shù)，采用簡便、快速、準(zhǔn)確、定量的實(shí)驗(yàn)室診斷方法具有十分重要的意義。

目前檢測風(fēng)疹常用ELISA法測定患者血清中的特異性風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體，該方法快速、靈敏，但是至少發(fā)病后5天才可以檢測到，并且容易引起假陽性反應(yīng)[3]；細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離法，用于臨床標(biāo)本中風(fēng)疹病毒檢測十分準(zhǔn)確，但操作復(fù)雜、步驟繁瑣，需要的檢測時間長；傳統(tǒng)PCR方法雖簡便快捷，但存在不能定量，易交叉污染等缺點(diǎn)。近年出現(xiàn)的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，融匯了PCR的高靈敏性、DNA雜交的高特異性以及光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點(diǎn)，直接探測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的結(jié)果，彌補(bǔ)了常規(guī)PCR易產(chǎn)生假陽性和不能定量兩大技術(shù)缺陷，避免了交叉污染，使其成為基礎(chǔ)研究和分子生物學(xué)診斷領(lǐng)域最熱門的技術(shù)之一[4]。

本研究建立了一種風(fēng)疹病毒RNA Taqman實(shí)時熒光定量RT-PCR方法，并采用傳統(tǒng)PCR制備了與目的片段一樣的定量陽性參考標(biāo)準(zhǔn)品，可以保證目的片段與標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率一致[5]。采用本研究制備的標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線(圖3)，線性相關(guān)系數(shù)r為-0.9993(r2=0.9986)，P<0.001，示不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品的自然對數(shù)值與相應(yīng)的Ct值具有良好的相關(guān)性，證實(shí)了本研究建立的風(fēng)疹病毒RNA Taqman實(shí)時熒光定量RT-PCR方法定量的高準(zhǔn)確性。因此建立的風(fēng)疹病毒RNA Taqman實(shí)時熒光定量RT-PCR方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、定量的特性，將其運(yùn)用于RV感染的早期臨床診斷，可為臨床風(fēng)疹診斷與治療提供及時準(zhǔn)確的依據(jù)，最大限度地降低育齡婦女風(fēng)疹病毒感染率，最大限度地減少死胎、畸胎等的發(fā)生率，使優(yōu)生優(yōu)育工作更上一個臺階，進(jìn)而提高全社會出生人口的素質(zhì)。

致謝：本研究得到了中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因公司的大力協(xié)助，在此表示衷心的感謝！

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