王 忱 趙曉輝 史玉榮 多 健 佟仲生

脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1/redox factor-1，APE1/ref-1)，又稱氧化還原因子-1，是人體內(nèi)1種重要的多功能蛋白，近年來研究發(fā)現(xiàn)，APE1在多種惡性腫瘤中呈過度表達(dá)，且與預(yù)后相關(guān)[1～3]，但與化療療效的關(guān)系未見報(bào)道。P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，是由MDR1基因編碼的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與化療耐藥密切相關(guān)。我們采用免疫組化方法，對非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)標(biāo)本中的APE1和P-gp進(jìn)行聯(lián)合檢測，以探討兩者表達(dá)的相關(guān)性及其與晚期非小細(xì)胞肺癌化療療效的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

我院2005年1月～2008年12月收治晚期非小細(xì)胞肺癌患者58例，其中男性35例，女性23例，年齡42～72歲，中位年齡56歲。所有患者均經(jīng)病理檢查確診，其中行支氣管鏡活檢29例，經(jīng)皮穿刺活檢18例，行縱隔及胸腔鏡活檢11例。根據(jù)WHO肺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，其中腺癌34例，鱗癌24例。根據(jù)AJCC癌癥分期第6版，其中ⅢB期37例，Ⅳ期21例。所有患者首選治療方案均為NCCN推薦的含鉑類聯(lián)合化療方案，其中NP方案11例(NVB 25 mg/m2，d1、8；DDP 80 mg/m2分3天，每21天) ;NC方案8例(NVB 25 mg/m2，d1、8；CBP 350 mg/m2，d1，每21天) ;TP方案12例(PTX 150 mg/m2，d1；DDP 80 mg/m2分3天，每21天)；TC方案20例(PTX 150 mg/m2，d1；CBP 350 mg/m2，d1，每21天);GP方案7例(GEM 900 mg/m2，d1、8；DDP 80 mg/m2分3天，每21天)。所有患者至少化療2個(gè)周期后采用2000年RECIST標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)療效。

1.2 試劑與方法

濃縮型鼠抗人APE1抗體購自于Novus Biologicals公司，濃縮型羊抗人P-gp抗體購自于Santa Cruz公司。免疫組化試劑盒購自于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。全部標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。免疫組化主要步驟如下：切片常規(guī)脫蠟至水；3%甲醇-過氧化氫阻斷過氧化物酶，室溫下孵育10 min后PBS洗3×5 min；抗原熱修復(fù)后PBS洗2×2 min；加山羊血清室溫下孵育20 min后傾去血清，滴加一抗，置于濕盒內(nèi)，4℃過夜；PBS洗3×2 min后滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育20 min；PBS洗3×2 min后滴加鏈霉菌生物素-過氧化物酶溶液室溫下孵育20 min；PBS洗 4×5 min，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水透明，封片。PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性切片做陽性對照。

1.3 結(jié)果判斷

APE1陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)及部分胞核，P-gp陽性物質(zhì)則定位于細(xì)胞膜，以腫瘤細(xì)胞陽性百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度進(jìn)行腫瘤陽性細(xì)胞計(jì)分。避開腫瘤邊緣及壞死區(qū)在高倍光鏡下選取10個(gè)視野，觀察計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。陽性細(xì)胞數(shù)記分： < 5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度記分：淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩項(xiàng)相加為最終判定結(jié)果：1分為(-)，2～3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分為(+++)，其中“-”和“+”記為低表達(dá)，而“++”和“+++”記為高表達(dá)。

化療有效率(response rate，RR)為腫瘤完全緩解率與部分緩解率之和，病情穩(wěn)定和進(jìn)展者視為化療無效，有效者1個(gè)月后再檢查確認(rèn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用χ2檢驗(yàn)及spearman 相關(guān)分析，以SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 APE1和P-gp表達(dá)與晚期NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

APE1表達(dá)主要分布于肺癌細(xì)胞的胞質(zhì)，部分分布于胞核，58例肺癌組織中45例呈高表達(dá)，13例呈低表達(dá)，APE1表達(dá)率鱗癌與腺癌比較并無差異，且其與患者性別、年齡及臨床分期無關(guān)。P-gp主要表達(dá)于肺癌細(xì)胞的胞膜，58例肺癌組織中28例呈高表達(dá)，30例呈低表達(dá)，其表達(dá)與患者性別、年齡及臨床分期無關(guān)，但其在腺癌中的表達(dá)率高于鱗癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 APE1和P-gp表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.2 NSCLC中APE1與P-gp表達(dá)的關(guān)系

45例APE1高表達(dá)NSCLC中，有25例P-gp呈高表達(dá)，20例P-gp呈低表達(dá)，但有10例兩者均呈低表達(dá)，本組NSCLC中APE1與P-gp表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(γ=0.271，P=0.040)。

2.3 APE1和P-gp表達(dá)與晚期NSCLC患者化療療效的關(guān)系

在應(yīng)用以鉑類為主化療方案的58例患者中，20例患者化療有效，38例患者化療無效，有效率為34.5%(20/58)。APE1高表達(dá)組、APE1低表達(dá)組、P-gp高表達(dá)組及P-gp低表達(dá)組中化療有效率依次為26.7%(12/45)、61.5%(8/13)、21.4%(6/28)和46.7%(14/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 APE1與P-gp表達(dá)與晚期NSCLC化療療效的關(guān)系(例，%)

3 討論

原發(fā)性肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率分別居男性惡性腫瘤的首位和女性惡性腫瘤的第2位，而死亡率在男性和女性惡性腫瘤中均為第1位[4]，其中因化療藥物耐藥而導(dǎo)致的治療失敗是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的1個(gè)重要因素。

APE1基因位于人第14號染色體，編碼蛋白約37 kD，含有318個(gè)氨基酸殘基，其N末端主要為氧化還原調(diào)控區(qū)，而C末端主要為核酸內(nèi)切酶活性區(qū)[5]。APE1是多功能的DNA堿基切除修復(fù)途徑的限速酶，是細(xì)胞DNA放射性和化學(xué)性損傷的重要修復(fù)因子，其過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞切除修復(fù)(base excision repair，BER)的完成。Robertson等[6]發(fā)現(xiàn)，APE1的過表達(dá)增強(qiáng)了生殖細(xì)胞瘤對博來霉素和放療的抗性；而Silber等[7]則發(fā)現(xiàn)APE1的內(nèi)切酶活性增加可以增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對烷化劑的抵抗性。因此，一般認(rèn)為APE1的表達(dá)增高伴隨DNA內(nèi)切酶活性的增強(qiáng)，和化療耐藥密切相關(guān)。同時(shí)，由于其結(jié)構(gòu)決定了APE1是1種重要的氧化還原因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種重要的核轉(zhuǎn)錄因子如HIF-1α，p53等的表達(dá)[8，9]，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)特性，因此，我們認(rèn)為該功能在腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制中可能產(chǎn)生更大的作用。

P-gp是由MDR1基因編碼的170 kD藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白位于細(xì)胞膜上，通過將化療藥物排出胞外而誘導(dǎo)耐藥。在腫瘤細(xì)胞中，它是1種內(nèi)在固有的藥物抵抗性機(jī)制，大量證據(jù)表明P-gp是許多惡性腫瘤耐藥性的關(guān)鍵因素之一。Ranajoy等發(fā)現(xiàn)APE1可能通過影響YB-1來進(jìn)一步促進(jìn)MDR1的表達(dá)[10]，此外Comford等亦證實(shí)MDR1基因上存在缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1 α，HIF-1α)的結(jié)合位點(diǎn)[11]，因此，APE1亦有可能通過上調(diào)HIF-1α的表達(dá)來增強(qiáng)MDR1即P-gp的表達(dá)，從而增加化療耐藥。

本研究回顧性的分析了58例晚期非小細(xì)胞肺癌，其中45例高表達(dá)APE1，在非小細(xì)胞肺癌中APE1表達(dá)與患者年齡、性別及病理類型等無明顯相關(guān)，這與Yoo等報(bào)道的相似[12]。本組病例僅納入了晚期即ⅢB期和Ⅳ期的患者，但未發(fā)現(xiàn)2種分期與APE1表達(dá)的關(guān)系。P-gp的高表達(dá)率為48.3%(28/58)，且在腺癌中的表達(dá)高于鱗癌，這與周庚寅等報(bào)道的一致[13]，略低于舒宏等報(bào)道的[14]。在25例APE1高表達(dá)的病理標(biāo)本中同時(shí)存在P-gp的高表達(dá)，APE1與P-gp在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)。在本組病例中，高表達(dá)APE1組的化療有效率低于低表達(dá)組，而高表達(dá)P-gp組的化療有效率也低于低表達(dá)組，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示我們APE1及P-gp的高表達(dá)與化療療效相關(guān)，兩者的過度表達(dá)可能增加非小細(xì)胞肺癌的化療耐藥。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在晚期非小細(xì)胞肺癌中APE1與P-gp的高表達(dá)與化療療效相關(guān)，可以用作預(yù)測晚期NSCLC化療效果的指標(biāo)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)在NSCLC中存在相關(guān)性，但APE1作為細(xì)胞內(nèi)重要的氧化還原因子，可能尚有其他的通路介導(dǎo)化療耐藥，值得我們進(jìn)一步去研究。

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