肖 婧 顧 藝 孫 琳 苗 青 焦偉偉 馮衛(wèi)星 吳喜蓉 郭雅潔 申阿東

細胞色素P450(CYP450)是人體內(nèi)最重要的藥物Ⅰ相代謝酶，主要分布在肝臟，在腸道、肺、腎和腦等組織中也有少量分布，該酶可促進氧化、羥化、脫烷基和脫氨基等反應的發(fā)生[1,2]。人類CYP450目前已發(fā)現(xiàn)了18個家族、44個亞家族[3～5]，其中CYP1、CYP2和CYP3家族占肝臟CYP450總量的80%以上，參與目前市場上90%以上藥物的代謝[6～8]，同時還對毒物、致癌物的活化與解毒有著重要作用。

20%～95%藥物療效和不良反應的個體差異由遺傳變異所決定[4]。遺傳變異決定了藥物代謝酶在不同個體中含量和活性的差異，從而導致不同個體對藥物反應的不同。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是決定個體間差異最主要的多態(tài)形式?？梢罁?jù)CYP450不同亞型的SNPs將人群劃分為不同的代謝表型[9]。CYP450亞型中某些位點的多態(tài)性可引起相應酶活性的升高、降低甚至失活。其中，位于啟動子區(qū)的CYP2E1 -1053C>T突變可使下游基因的轉錄和表達水平提高10倍以上[10]；位于外顯子區(qū)的CYP3A4 878T>C突變可引起氨基酸改變，使CYP3A4酶活性呈輕至中度增強[11,12]；位于外顯子區(qū)的CYP2D6 100C>T和CYP2C9 1075A>C突變可引起氨基酸改變，使相應酶活性明顯下降[13,14]；位于內(nèi)含子區(qū)的CYP2E1 7632T>A突變引起酶活性降低的原因尚不明確[10]；而位于外顯子區(qū)的CYP2C19 636G>A、681G>A/C和位于內(nèi)含子區(qū)的CYP3A5 6986A>G突變則分別導致終止密碼和異常剪切，從而使翻譯提前終止或產(chǎn)生無功能的截短蛋白[12,13]。

目前，中國漢族人群CYP450基因型和代謝表型的研究已有報道，為進一步了解CYP450亞型重要SNPs及其代謝表型在中國漢族人群的分布，豐富和完善中國漢族人群相關遺傳學數(shù)據(jù)庫，本研究通過實時PCR基因分型法，對中國漢族分析人群CYP450 6個亞型的8個SNPs位點進行檢測，為今后從分子水平進行個體化用藥提供依據(jù)。

1 方法

1.1 樣本來源和選擇 選擇2005年3月至2008年12月首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院門診及病房收治的漢族患兒，并除外患有嚴重感染性疾病、自身免疫性疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、遺傳性疾病及先天性疾病患兒。以進行血生化的檢測剩余血樣量能保證本研究血樣需要量的1 200份作為研究樣本，使用隨機數(shù)字表法從中隨機選取其中的300份進行CYP450基因型檢測。

1.2 倫理審核 本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院倫理委員會審核通過。300份進行CYP450基因型檢測患兒不謀求其社會人口學和病史資料

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA抽提 取EDTA抗凝靜脈血2 mL，采用改進的Miller鹽析法抽提全血中人基因組DNA，溶于TE溶液，經(jīng)分光光度計測定濃度后，于-20℃保存。

1.3.2 SNPs位點的選擇 SNPs的選擇依據(jù)主要基于2點：①可引起CYP450含量或活性改變的SNPs；②在HapMap(The International HapMap Project，國際人類基因組單體型圖計劃)數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)中，中國漢族人群的次要等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>2%的SNPs?；诖?，本研究共選取CYP450 6個亞型(CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4和CYP3A5)的8個SNPs位點進行突變檢測，基本信息見表1。

表1 CYP450 6個亞型的8個SNPs位點的基本信息

Notes 1) The major allele names were accordant with Human Cytochrome P450 Allele Nomenclature Committee (http://www.cypalleles.ki.se/index.htm); 2) Rs was NCBI dbSNP

1.3.3 PCR擴增 CYP450亞型SNPs位點檢測的引物及探針的序列(ABI公司合成)見表2，目的片段擴增使用TaqMan SNPs genotyping Assays在MJ Opticon-2(CYP2E1的2個位點)和Stratagene-Mx3005P熒光定量檢測儀(其余的6個位點)上進行PCR擴增。擴增條件為：95℃ 10 min；92℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。每個循環(huán)結束時測定每孔的A值，擴增循環(huán)結束后，根據(jù)定量PCR儀分析軟件獲得的熒光曲線及Ct值來判定樣品的SNP類型，并用DNA測序結果來驗證實時PCR檢測結果的準確性。

1.4 代謝表型的定義 依據(jù)文獻[15，16]可分為4種不同的代謝表型：①慢代謝型：含有2個使酶活性完全喪失的等位基因(突變純合子)；②中間代謝型：含有2個使酶活性減弱的等位基因(突變純合子)；③快代謝型：正常表型，具有2個正常等位基因(野生型純合子)，或具有1個使酶活性減弱或喪失的突變等位基因(突變雜合子)；④超快代謝型：含有多個拷貝或具有使酶活性增強的等位基因。

1.5 不同人群CYP450亞型突變等位基因頻率對比分析 應用主題詞或關鍵詞 “P450”、“cytochrome”、“gene”和“polymorphisms”，檢索1996年1月至2009年12月PubMed、OVID及中國生物醫(yī)學文獻光盤數(shù)據(jù)庫，收集高加索人群、日本人群以及非洲黑種人群的CYP450亞型等位基因頻率的文獻，并輔以文獻追溯的方法，手工檢索相關的參考文獻，入選的文獻需有相關的基因型和等位基因頻率的數(shù)據(jù)。各人群和各SNPs位點均選擇1篇樣本量大、方法可靠和種族特點明確的文獻與本研究中國漢族分析人群CYP450 6個亞型的8個SNPs位點等位基因頻率進行對比分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 使用SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)統(tǒng)計各SNP位點等位基因頻率和基因型頻率分布，各SNP位點基因頻率行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(HWE)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義[17]。采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。

表2 CYP450 6個亞型的8個SNPs位點突變檢測的引物和探針序列

2 結果

2.1 一般情況 300份中國漢族分析人群男性182例，女性118例，年齡0.2～16.0歲，平均年齡(5.0±4.3)歲。

2.2 CYP450亞型各SNP位點基因型和等位基因頻率分布 CYP450 6個亞型的8個SNPs位點的PCR基因測序結果見圖1。各位點等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P均>0.05)，表明樣本具有群體代表性(表3)。

如表3所示，CYP2C19 681G>A/C、CYP2D6 100C>T和CYP3A5 6986A>G位點的野生型雜合子基因型頻率在本研究漢族分析人群中的分布較高，分別為46.3%、47.0%和43.7%；CYP2D6 100C>T和CYP3A5 6986A>G突變純合子的頻率均高于野生型純合子的頻率(35.3%vs17.7%，41.7%vs14.7%)。CYP2C19 681G>A/C、CYP2D6 100C>T和CYP3A5 6986A>G位點的突變等位基因頻率也較高，分別為34.5%、58.8%和63.5%。CYP2C9 1075A>C、CYP2C19 636G>A、CYP2E1 -1053C>T、CYP2E1 7632T>A和CYP3A4 878T>C位點的野生型純合子基因型頻率較高，分別為100%、89.3%、61.3%、58.3%和98.0%，CYP2C9 1075A>C、CYP3A4 878T>C位點的野生型雜合子基因型頻率較低，僅為0和2.0%。

圖1 CYP450 6個亞型的8個SNPs位點的PCR基因測序結果

Fig 1 Results of sequencing of 8 SNPs in 6 CYP450 subtypes

Notes A:CYP2C9 1075A>C;B,C:CYP2C19 636G>A;D-F:CYP2C19 681G>A/C;G-I:CYP2D6 100C>T;J-L:CYP2E1 -1053C>T;M-O:CYP2E1 7632T>A;P,Q:CYP3A4 878T>C;R-T:CYP3A5 6986A>G

表3 300例中國漢族分析人群CYP450各亞型SNP位點基因型和等位基因的頻率分布[n(%)]

Notes 1) The genotype and allele frequencies of another SNP in CYP2C19 681 locus (wild heterozygote GC, mutant homozygote CC, and mutant allele C) were zero, data was not shown

2.3 中國漢族分析人群CYP450各亞型突變等位基因與其他人群的對比分析 CYP3A4 878T>C位點在歐洲高加索人群和非洲黑種人群中未找到相關數(shù)據(jù)。本研究中國漢族分析人群CYP450 6個亞型8個SNPs位點的突變等位基因頻率與日本人群[18～23]較為接近，與歐洲高加索人群[24～28]和非洲黑種人群[29～32]有較大差異。CYP2C19 681G>A/C、CYP2D6 100C>T和CYP3A5 6986A>G位點的突變等位基因頻率在中國漢族分析人群和日本人群中較高，CYP3A5 6986A>G位點的突變等位基因頻率在歐洲高加索人群中分布亦較高。其余5種突變等位基因頻率在中國漢族分析人群和日本人群中較低。

圖2 CYP450各亞型突變等位基因在不同人群中的分布

Fig 2 The distribution of mutant alleles in CYP450 subtypes in different race population

Notes The data of CYP3A4 878T>C in European Gaucasian and African Black ethnic or regional groups were not found

2.4 中國漢族人群CYP450代謝表型的分布 由表4可見，CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4和CYP3A5的快代謝型和超快代謝型比例分別100%，83.3%，64.7%，95%，100%和58.3%。CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5的中間代謝型和慢代謝型比例分別為11.4%、35.3%和41.7%，高于CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的中間代謝型和慢代謝型比例(分別為0，5.0%和0)。由于慢代謝型的劃分還需明確該基因其他多態(tài)性位點的情況，且該型在人群中的比例較低，可初步提示此3種CYP450亞型的中間代謝型在中國漢族分析人群中的比例較高。CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的快代謝型和超快代謝型的比例非常高，分別為100%、95.0%和100%，由于超快代謝型的劃分還需明確該基因其他多態(tài)性位點的情況，且該型在人群中的比例較低，初步提示此3種CYP450亞型的快代謝型在中國漢族分析人群中的比例較高。

表4 300例中國漢族分析人群CYP450代謝表型的分布[n(%)]

Tab 4 Metabolic phenotype frequencies of CYP450 subtypes in 300 cases of Chinese Han population[n(%)]

SubtypesPMand/orIMEMand/orUMCYP2C91075C/C0(0)1075A/A；1075A/C300(100)CYP2C191)681A/Aand636G/G681G/Gand636A/A681A/Aand636G/A681G/Aand636A/A681A/Aand636A/A34(11．4)681G/Gand636G/G681G/Gand636G/A681G/Aand636G/G250(83．3)CYP2D6100T/T106(35．3)100C/C；100C/T194(64．7)CYP2E12)7632A/Aand?1053C/C7(2．3)7632T/Tand?1053C/C7632T/Aand?1053C/C7632T/Aand?1053C/T7632T/Tand?1053C/T7632T/Tand?1053T/T7632T/Aand?1053T/T285(95．0)CYP3A4--878T/T；878T/C；878C/C300(100)CYP3A56986G/G125(41．7)6986A/A；6986A/G175(58．3)

Notes PM:Poor metabolizer; IM: Intermediate metabolizer;EM: Extensive metabolizer; UM:Ultrarapid metabolizer;1) The metabolic phenotype of individuals with genotype combination as ′681G/681A and 636G/636A′ [16(5.3)] could not be determined. 2) The metabolic phenotype of individuals with genotype combination as ′7632A/7632A and -1053C/-1053T′ [5(1.7)], ′7632A/7632A and -1053T/-1053T′ [3(1.0)] could not be determined；"-":because of the increasing effect of this variant, the PM and/ or IM could not be existed

3 討論

本研究結果顯示，CYP2C19 681G>A/C、CYP2D6 100C>T、CYP3A5 6986A>G突變等位基因的頻率較高，均可引起酶活性降低或缺失，說明在中國漢族人群中可能有一部分個體因為這3個位點的突變引起相應酶活性的降低，可入選本研究后續(xù)優(yōu)化SNPs位點的研究；而CYP2C9 1075A>C、CYP2C19 636G>A和CYP3A4 878T>C突變等位基因的頻率則較低，提示由此引起的相應酶活性的改變對中國人群的影響可能較小。本研究CYP2C9 1075C等位基因頻率為0，與既往的研究結果(3.5%)[33]不一致，可能與人群的選擇不同有關?？稍诤罄m(xù)的研究中，考慮增加其他多態(tài)性較高或與代謝表型緊密相關的SNPs檢測位點，從而篩選出能代表中國漢族人群遺傳特點的SNPs位點優(yōu)化組合方式。

另外，通過與不同種族人群的既往研究結果對比分析發(fā)現(xiàn)，中國漢族分析人群CYP450各亞型的突變等位基因與高加索人群和黑種人群有種族上的差異，而與日本人群較為接近。提示CYP450基因型存在種族差異。但這些既往研究多以單個亞型進行研究，而本研究則對CYP450 6個亞型的8個SNPs位點進行檢測，獲得了更多的關于中國漢族人群CYP450不同亞型的遺傳學數(shù)據(jù)，對個體化用藥的指導更具意義。

目前，調(diào)整個體化用藥主要通過血藥濃度的監(jiān)測，而利用基因檢測來指導個體化用藥還處于起步階段，雖在部分藥物如華法林、β2受體拮抗劑已有小范圍的推廣[21,34]，但尚無臨床通用指導標準。采用探針藥物是目前確定代謝表型的公認方法，但需受試者服用探針藥物，采血測定原藥和代謝產(chǎn)物的血藥濃度，依從性較差。因此根據(jù)多態(tài)性位點確定代謝表型是一種可行的方法。本研究選取的CYP450 6個亞型的8個SNPs位點均為已被既往研究證實可影響其代謝表型的位點。由于藥物代謝酶的編碼基因常存在多個功能性多態(tài)性位點，僅根據(jù)一個多態(tài)性位點來判斷個體的代謝表型有一定局限性，因此本研究采用基因分型結果來預測代謝表型可能有一定誤差。但本研究將慢代謝型與中間代謝型、快代謝型與超快代謝型進行合并分析，由于慢代謝型和超快代謝型在人群中的比例非常低，因此本研究的結果仍可初步反映中國漢族人群各CYP450亞型的中間代謝型和快代謝型的分布態(tài)勢。

不同代謝表型的個體應采用不同的用藥方案。本研究結果顯示，中國漢族分析人群中CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5中間代謝型和慢代謝型占較高比例(分別為11.4%、35.3%和41.7%)，因此建議對CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5進行SNPs的檢測，確定其代謝表型，如為中間代謝型或慢代謝型的患者應適當減少用藥劑量或延長用藥間隔時間，并密切監(jiān)測藥物的不良反應。而對于CYP2E1和CYP3A4超快代謝型個體，則可適當增加用藥劑量或縮短用藥間隔時間。

除本研究選取的SNPs外，仍存在其他可影響CYP450代謝表型的遺傳變異，如插入、缺失、隨機重復和微衛(wèi)星等[35～37]，以及其他未發(fā)現(xiàn)和未入選的SNPs。進一步檢測影響CYP450代謝表型的其他遺傳變異、或補充SNPs檢測位點，以提高預測結果的準確性；但過多位點的入選會增加經(jīng)濟和人力成本，不利于該技術的推廣應用。因此，如何平衡好這兩者的關系，是將來進行個體化用藥研究所面臨的主要問題。

本研究的不足之處和局限性：①樣本人群可能存在選擇偏倚；②未采用探針藥物確定代謝表型，使本研究代謝表型結果存在一定誤差。

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