徐寒子

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方常見惡性腫瘤,發(fā)病率高達(dá)10～30/10萬，放射治療是其主要治療手段，然而療效不盡人意，5年生存率多年來徘徊在50%[1]。因此，尋找治療鼻咽癌的新藥，是當(dāng)前鼻咽癌防治研究的熱點(diǎn)。近年來惡性腫瘤最大的治療進(jìn)展莫過于針對不同靶點(diǎn)的新型靶向藥物的不斷開發(fā)與使用，其中作用于表皮生長因子受體(EGFR)的靶向藥物是較為重要的一類[2-3]。研究表明，EGFR單克隆抗體之一的西妥昔單抗能顯著抑制包括肝癌、鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的生長。我們的前期工作已證實(shí)，西妥昔單抗對人鼻咽癌細(xì)胞株CNE存在一定的抑制作用[4]，本研究旨在探討其對CNE細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)及其分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料 注射用西妥昔單抗(2 mg/mL)為美國ImClone公司產(chǎn)品，RPMI 1640系GIBCO公司產(chǎn)品，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰蛋白酶、Hoechst 33258購自SIGMA公司，AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國BIPEC公司，鼠抗Bax、Bcl-2單抗購自SANTA CRUZ公司，鼠抗β-Actin單抗購自聯(lián)科生物，羊抗鼠IgG-Ap抗體、顯色試劑盒購自武漢華美生物。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細(xì)胞株CNE購于中科院上海細(xì)胞庫，生長在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，于37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，每2～3 d換液傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 熒光染色法觀察CNE細(xì)胞凋亡形態(tài) 將干凈無菌的蓋玻片置于30 mm2培養(yǎng)皿，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按105/皿的密度接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞爬片融合達(dá)50%～80%時(shí)，小心更換培養(yǎng)液后分別加入終濃度為10 μg/mL的西妥昔單抗(實(shí)驗(yàn)組)或等量的無血清培養(yǎng)基(對照組)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后吸盡培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入Hochest 33258染液(5 mg/L)室溫避光染色10 min，雙蒸水洗滌，吸去多余液體后封片，在熒光顯微鏡下(德國Leica)觀察并隨機(jī)拍照。

1.4 透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu) 接種1×106/mL細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，分別加入終濃度為10 μg/mL的C225或等體積的無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后以戊二醛和鋨酸固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，經(jīng)醋酸鈾、檸檬鉛雙染后上透射電鏡(日本HITACHI)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率 細(xì)胞處理同1.3，48 h 后消化收集細(xì)胞；冷PBS洗2遍，用Binding緩沖液重懸調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，取100 μL懸液，先后加入5 μL細(xì)胞凋亡檢測試劑Annexin V-FITC和10 μL PI并分別于4℃避光孵育5 min，上流式細(xì)胞儀(BD，美國)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以均值代表測定結(jié)果。

1.6 Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá) 接種1×106/mL細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，分別加入終濃度為1、10、100 μg/mL的西妥昔單抗或等量的無血清培養(yǎng)基(對照組)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入400 μL裂解液冰上裂解30 min，4℃12 000rpm離心5 min 取上清液，95℃變性5 min，蛋白定量后加上樣緩沖液調(diào)整至濃度相同。各取15 μL，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入對應(yīng)的一抗溶液，4℃孵育過夜，TBST振蕩洗滌15 min，3次后加入二抗，室溫孵育2 h，TBST振蕩洗滌15 min，3次，AP顯色。運(yùn)用圖像分析儀(上海培清，A-380)對結(jié)果進(jìn)行圖像分析，計(jì)算條帶的積分吸光度，以β-Actin水平作為等量蛋白上樣參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以均值代表測定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Hochest 33258結(jié)果 Hochest 33258是一種親核染料，被活細(xì)胞攝取后在熒光顯微鏡下觀察, 正常細(xì)胞呈均勻的淺藍(lán)色熒光，細(xì)胞邊緣整齊；凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)因固縮而呈致密濃染，或因胞核碎裂而呈大小不等的圓形小體(凋亡小體)。本實(shí)驗(yàn)對照組可見活細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，未見凋亡細(xì)胞(圖1-A)；而西妥昔單抗處理組可見較多凋亡細(xì)胞，胞核碎裂凝集成典型的凋亡小體(圖1-B箭頭標(biāo)注處)。

圖1 Hochest 33258染色對照組(A)西妥昔單抗實(shí)驗(yàn)組(B) CNE凋亡形態(tài)學(xué)改變(×400)

2.2 透射電鏡結(jié)果 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)對照組CNE細(xì)胞表面有長短不一的微絨毛伸展，細(xì)胞核核膜清晰，染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀，核仁清晰，未見典型細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)改變(圖2-A)；而西妥昔單抗組CNE細(xì)胞微絨毛消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞質(zhì)濃縮，胞核深染，核染色質(zhì)固縮成塊并邊集，出現(xiàn)凋亡小體(圖2-B箭頭標(biāo)注處)。

圖2 透射電鏡對照組(A)西妥昔單抗實(shí)驗(yàn)組(B) CNE細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變(×6000)

2.3 AnnexinV-PI雙染流式檢測結(jié)果 經(jīng)AnnexinV-FITC和PI雙染色后，在FCM圖上表現(xiàn)為AnnexinV-FITC陽性而PI陰性的細(xì)胞，即為處于早期凋亡階段而非死亡的細(xì)胞。經(jīng)西妥昔單抗作用48 h后，CNE細(xì)胞凋亡率為(15.30±0.95)% (圖3-A、B、C)，顯著高于對照組的(4.70±0.60)% (圖3-D、E、F)。

圖3 對照組(A、B、C)西妥昔單抗組(D、E、F)部分流式細(xì)胞檢測結(jié)果

2.4 Western Blot結(jié)果 以Western Blot方法分析西妥昔單抗作用CNE細(xì)胞48 h后Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：Bax蛋白(23kd)隨濃度的增加而逐漸上調(diào)，而Bcl-2蛋白(26kd)則剛好相反，隨濃度的增加而逐漸下調(diào)(圖4-A)；以β-Actin水平為等量蛋白上樣參照，分析Bax/Bcl-2比值變化情況，結(jié)果顯示：西妥昔單抗組顯著高于對照組(P<0.05)，并隨濃度的增加而逐漸升高，處理組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4-B)。

圖4 Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)Western Blot結(jié)果#表示較對照組(0 μg/mL)有顯著差異(P<0.05)，*表示處理組間有顯著差異(P<0.05)

3 討論

目前靶向EGFR治療的藥物主要有兩類, 一種為針對EGFR胞內(nèi)部分的小分子酪氨酸激酶抑制劑，如厄洛替尼，此類藥物可與ATP競爭EGFR胞內(nèi)部分酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域上的ATP 結(jié)合位點(diǎn)，阻斷由EGFR活化引起的一系列胞內(nèi)級聯(lián)酶促反應(yīng)，阻止活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)；另一類是針對EGFR胞外部分的單克隆抗體，如西妥昔單抗，此類藥物可與EGF、TGF等配體競爭EGFR分子上的特殊結(jié)合位點(diǎn)，阻斷配體對受體的激動作用，并下調(diào)其在胞膜的表達(dá)水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。已有的研究顯示西妥昔單抗對于EGFR高表達(dá)的結(jié)直腸癌、頭頸癌、非小細(xì)胞肺癌等已有較為明確的療效。

盡管EGFR及其靶向治療對于鼻咽癌治療意義和價(jià)值尚不十分明確，但是可以肯定，在各種病理類型的鼻咽癌組織和癌旁組織中均存在有EGFR的高表達(dá)[5-6]，提示EGFR 及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有相當(dāng)重要的意義，阻斷EGFR及其信號通路對鼻咽癌可能具有一定的治療作用。

我們的前期工作已證實(shí)，西妥昔單抗對人鼻咽癌細(xì)胞株CNE存在一定的增殖抑制作用[4]；同時(shí)，鑒于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅是細(xì)胞增殖失控的結(jié)果,也是細(xì)胞凋亡受限的結(jié)果，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也同樣有著重要的腫瘤治療學(xué)意義[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)嘗試了觀察西妥昔單抗對鼻咽癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

Hochest 33258熒光法揭示了CNE細(xì)胞胞核染色質(zhì)從聚集濃縮到裂解為碎塊再到形成凋亡小體的典型凋亡形態(tài)學(xué)變化過程；透射電鏡結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)CNE細(xì)胞經(jīng)西妥昔單抗處理后存在超微結(jié)構(gòu)的凋亡特征性改變； AnnexinV-PI雙染流式細(xì)胞檢測確證，經(jīng)西妥昔單抗作用48 h后處于早期凋亡階段的CNE細(xì)胞為(15.30±0.95)%，顯著高于對照組(P<0.05)。提示西妥昔單抗體外可顯著誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE凋亡。

細(xì)胞凋亡不同于壞死，它涉及一系列蛋白的表達(dá)與調(diào)控，其中Bcl-2家族是最重要的凋亡相關(guān)蛋白之一。Bcl-2家族分為兩類：凋亡抑制蛋白(如Bcl-2等)和凋亡誘導(dǎo)蛋白(如Bax等)，兩類蛋白的相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞是凋亡還是存活[8]。本實(shí)驗(yàn)顯示西妥昔單抗作用CNE細(xì)胞48 h后Bax蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白的相對表達(dá)強(qiáng)度顯著下調(diào)。由于Bax與Bcl-2相互作用可能還是以兩者間的比值來決定細(xì)胞的生存與凋亡，因而，我們又比較了Bax與Bcl-2的比值，結(jié)果顯示：西妥昔單抗組顯著高于對照組(P<0.05)，并隨濃度的增加而逐漸升高。提示西妥昔單抗可能是通過上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2，進(jìn)而上調(diào)Bax/Bcl-2比值來誘導(dǎo)CNE細(xì)胞凋亡的。鑒于細(xì)胞內(nèi)信號傳遞途徑十分復(fù)雜，更確切的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

總之，西妥昔單抗對人鼻咽癌細(xì)胞株CNE有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)Bax并下調(diào)Bcl-2而實(shí)現(xiàn)，其確切機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

[1] 龐學(xué)利, 孫華明, 肖紅, 等. 放射治療對鼻咽癌患者遺傳學(xué)指標(biāo)的影響[J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志, 2004, 24 (5): 448-450.

[2] Langer CJ. Targeted therapy in head and neck cancer: state of the art 2007 and review of clinical applications[J]. Cancer, 2008, 112(12): 2635-2645.

[3] Zureikat AH, McKee MD. Targeted therapy for solid tumors: current status[J]. Surg Oncol Clin N Am, 2008, 17(2):279-301.

[4] 王仁生, 徐寒子, 黃光武, 等. 西妥昔單抗聯(lián)合放射及加熱誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞系凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華放射腫瘤學(xué)雜志, 2009, 18(4):289-290.

[5] Ma BB, Poon TC, To KF, et al. Prognostic significance of tumor angiogenesis, Ki 67, p53 oncoprotein, epidermal growth factor receptor and HER2 receptor protein expression in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma—a prospective study [J]. Head Neck, 2003, 25(10):864-872.

[6] Chua DT, Nicholls JM, Sham JS, et al. Prognostic value of epidermal growth factor receptor expression in patients with advanced stage nasopharyngeal carcinoma treated with induction chemotherapy and radiotherapy[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004, 59(1):11-20.

[7] Melet A, Song K, Bucur O,et al. Apoptotic pathways in tumor progression and therapy [J]. Adv Exp Med Biol, 2008, 615: 47-79.

[8] Adams JM, Cory S. Bcl-2-regulated apoptosis: mechanism and therapeutic potential [J]. Curr Opin Immunol, 2007, 19(5):488-496.