高曉潔 李永柏 谷澤隆邦

腎間質纖維化是各類慢性腎臟疾病進展到終末期的主要病理特征。無論腎臟病原發(fā)病因和部位在腎小球、腎小管抑或腎血管，幾乎所有的進展性腎病均可見到腎小管間質纖維化。大量研究表明，腎間質纖維化的程度與腎功能的相關性較腎小球硬化與腎功能的相關性更為密切[1～3]。積極探索阻抑腎間質纖維化發(fā)生、發(fā)展的治療手段，對改善腎臟病的預后至關重要。因此，近年來圍繞腎小管間質損傷的發(fā)病機制和防治措施方面的研究逐漸受到國內外學者的廣泛重視。

血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(RAS)最主要的活性物質，已證實在梗阻性腎病中，AngⅡ表達明顯增加[4]。在AngⅡ的AT1受體基因敲除后，梗阻早期即可抑制巨噬細胞的浸潤和轉化生長因子-β1(TGF-β1)mRNA及Ⅲ型膠原的表達，而腎間質容積在梗阻后2～5 d顯著下降[5]。由此可見，AngⅡ參與了梗阻性腎病腎間質纖維化的形成和發(fā)展。Klahr等[6]應用血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)及AT1受體拮抗劑抑制AngⅡ生成、表達和活化后，可顯著減少細胞外基質(ECM)的沉積及成纖維細胞的增殖，提示AngⅡ是對腎間質纖維化影響最為明顯的血管活性物質。

喹那普利是1989年在美國上市的含羧基類ACEI，具有安全劑量范圍大，毒性作用和不良反應小等優(yōu)點。近年來，國外許多學者已將喹那普利廣泛應用于治療鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病腎病，腎大部切除誘發(fā)的慢性腎功能不全和持續(xù)性不臥床腹膜透析(CAPD)并發(fā)的腹膜硬化等[7～9]，在上述研究中喹那普利均被證實有顯著的抗增殖和抗纖維化作用。目前，國內關于喹那普利干預單側輸尿管結扎(UUO)腎小管間質纖維化進程的研究尚未見報道。本研究通過分析喹那普利對大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達、腎間質容量、腎組織α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及TGF-β1蛋白水平的影響，為探索喹那普利保護腎臟功能的作用機制提供實驗依據。

1 方法

1.1 實驗動物分組及處置 5周齡雄性SD大鼠30只(體重150～180 g，日本兵庫醫(yī)科大學醫(yī)學動物實驗中心提供)，以隨機數字法分為3組：假手術組6只，UUO組及喹那普利組各12只。模型建立方法[10]簡述如下：以戊巴比妥50 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，在無菌條件下分離出左側輸尿管，上下兩端結扎后離斷。假手術組除不結扎離斷輸尿管外，余步驟同UUO組。喹那普利組在UUO前1 d予喹那普利10 mg·kg-1·d-1灌胃，假手術組及UUO組予同等體積生理鹽水灌胃。各組的半數大鼠分別于術后14及28 d處死，取左腎組織，部分置于4%多聚甲醛液中固定，用于Masson染色和免疫組化實驗；部分速凍于-80℃液氮中備用于原位雜交實驗。動物實驗在日本兵庫醫(yī)科大學動物實驗室完成，并得到該校實驗動物關愛委員會的批準。實驗動物在清潔恒溫(22℃)環(huán)境下飼養(yǎng)，予普通飼料喂養(yǎng)，進食、水的量不限。

1.2 主要藥品與試劑 喹那普利(每片10 mg，日本田邊三菱制藥株氏會社提供)，鼠TGF-β1cDNA (498 bp ,818-1315)探針(日本兵庫醫(yī)科大學提供)；DIG RNA Labeling Kit (Boehringer Mannheim公司，德國)；兔抗DIG/HRP 抗體 (Dako, 美國)；兔抗TGF-β1多克隆抗體(Santa Cruz，美國)；鼠抗α-SMA單克隆抗體(Novo Castra，英國)；羊抗兔或鼠IgG (Envision+TM, Peroxidase, Dako，美國)。

1.3 大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達檢測 采用原位雜交法檢測，按DIG RNA labeling kit操作說明書進行合成和標記TGF-β1cRNA 探針。原位雜交主要步驟：冰凍切片(厚6～8 μm)以4%多聚甲醛液(pH 7.2)固定，經0.2 mmol·L-1HCl處理后予蛋白酶K 10 ng·L-1消化30 min，每張切片滴加預雜交液預雜交1 h，然后加入1 mg·L-1DIG-labeled TGF-β1cRNA 探針，50℃雜交16 h，充分洗滌后滴加兔抗DIG/HRP 抗體(1∶250) 室溫孵育30 min。緩沖液洗滌后滴加生物素化過氧化物酶，經DAB顯色加蘇木精復染后脫水封片。

1.4 大鼠腎組織α-SMA和TGF-β1蛋白水平的檢測 2 μm厚石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用Target retrieval 試劑 (pH 6.0; Dako, 美國) 115～121℃微波6～10 min進行抗原熱修復，浸入1% H2O2液20 min消耗內源性過氧化酶，分別滴加兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(1∶100)和鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體4℃過夜，清洗后滴加相應二抗(羊抗兔或鼠IgG)室溫靜置30 min，以DAB 底物顯色并加蘇木精輕度復染后常規(guī)脫水封片。

1.5 腎小管間質損害病理學檢查 按常規(guī)方法進行Masson染色，光鏡下觀察腎小管間質的病理改變。

1.6 實驗結果半定量分析 對各組大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達、腎小管間質容量、α-SMA和TGF-β1蛋白水平進行半定量分析。對實驗分組不知曉的2名觀察者采用經典的point-counting 法[10～12]進行統計計數。具體方法：以帶有11×11等距網格線測微尺的目鏡觀察，400倍鏡下隨意選取20個連續(xù)但不重疊視野(含有腎小球及大血管的視野不納入觀察視野)，網格交叉點陽性染色者計數并求其平均值。

2 結果

實驗過程中3組大鼠均無死亡。假手術組術后2和4周的實驗結果差異無統計學意義，故將其合并作為對照組進行實驗結果分析。

2.1 各組大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達的比較 假手術組可見TGF-β1mRNA廣泛存在于腎小球系膜細胞，腎小管上皮細胞及間質細胞中(圖1A、B)，在正常情況下雜交信號散在而微弱。UUO組腎組織中TGF-β1mRNA表達水平劇增，尤其在擴張或萎縮腎小管上皮細胞及增生的間質細胞中的表達更為明顯(圖1C)，梗阻終末期腎小管間質細胞中TGF-β1mRNA的雜交信號已呈現堆積現象(圖1D)；相對而言，腎小球中TGF-β1mRNA表達水平增加并不明顯。喹那普利組腎小管間質TGF-β1mRNA的表達較同時期UUO組明顯減少(圖1E、F，表1)。

GroupsTGF?β1mRNARenalinterstitialvolumeTGF?β1proteinα?SMASham8．6±2．34．7±1．23．7±0．82．3±0．6Quinapril(2weeks)35±61，2)19±51，3)14±41，3)15±41，2)UUO(2weeks)62±81)30±61)25±71)22±51)Quinapril(4weeks)39±61，2)43±71，3)30±41，3)30±61，2)UUO(4weeks)69±71)55±61)39±61)44±91)

Notes 1)P<0.01,vssham group; 2)P<0.01, 3)P<0.05, Quinapril groupvsUUO group at the same time.n=6 for each group

2.2 各組大鼠腎小管間質病理改變 假手術組顯示正常的腎小管間質形態(tài)(圖2A)。UUO組術后2周時腎小管上皮細胞腫脹，小管明顯萎縮或擴張，伴有不同程度的間質增生和膠原形成(圖2B)；UUO組術后4周時萎縮塌陷的腎小管明顯增加，腎間質纖維化程度亦明顯加重(圖2C)。喹那普利組與同時期的UUO組比較，腎小管萎縮塌陷、小管上皮細胞腫脹及間質擴張的情況明顯減少(圖2D)，尤其在4周時腎間質纖維組織增生程度明顯抑制(圖2E，表1)。

圖1 各組大鼠腎組織TGF-β1mRNA的表達(原位雜交，×200)

Fig 1 Expression of TGF-β1mRNA in the experimental rat renal tissues in different groups(in situ hybridization, ×200)

Notes A: sham group at 2 weeks time point; B:sham group at 4 weeks time point;C:UUO group at 2 weeks time point; D:UUO group at 4 weeks time point; E: Quinapril group at 2 weeks time point; F:Quinapril group at 4 weeks time point.TGF-β1mRNA positive signals were detected in glomerular mesangeal cells, tubular epithelial cells and interstitium. The hybridized signals were weak in sham kidney, much stronger in renal tissues both 2 weeks and 4 weeks after UUO operation, no increasing expression of TGF-β1mRNA was found in glomeruli of UUO kidney

圖2 各組大鼠腎小管間質病理改變(Masson染色，×200)

Fig 2 Morphological changes of relative interstitial volume in each group(Masson's trichrome stain,×200)

Notes A: sham group at 2 weeks time point; B:UUO group at 2 weeks time point; C:UUO group at 4 weeks time point; D: Quinapril group at 2 weeks time point; E:Quinapril group at 4 weeks time point. Tubular atrophy or dilation and interstitial fibrosis were obvious in renal tissues of UUO group, especially at 4 weeks time point post-operation. Compared with UUO group, tubulointerstitial fibrosis hallmarked by interstitial volume was markedly decreased in quinapril group

2.3 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白和α-SMA水平 假手術組腎小球系膜細胞，腎小管上皮細胞及間質細胞中可見極少量TGF-β1蛋白陽性染色(圖3A)。UUO組腎小管上皮細胞中可見強陽性染色的TGF-β1蛋白表達，在萎縮塌陷的腎小管上皮細胞中其表達尤為明顯(圖3B)。UUO組術后4周時腎臟中TGF-β1蛋白在小球系膜、極度擴張及萎縮的腎小管及間質細胞中均呈現強陽性表達(圖3C)，提示TGF-β1蛋白在腎間質纖維化的進程中可能具有非常重要的促進作用。喹那普利組腎小管間質中TGF-β1蛋白的表達明顯受抑，間質增生及腎小管萎縮現象亦明顯減輕(圖3D、E，表1)。

假手術組α-SMA僅在腎小血管壁肌細胞和極少量間質細胞中表達(圖4A)。UUO組α-SMA主要存在于腎間質細胞及小血管壁，隨著腎纖維化的逐漸加重，腎間質細胞增生，成纖維細胞堆積，α-SMA呈強陽性染色(圖4B、C)；喹那普利組由于腎間質增生明顯受抑，α-SMA表達亦相應明顯減少(圖4D、E，表1)。

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白的表達(免疫組化，×200)

Fig 3 Expression of TGF-β1protein immunohistochemically in renal tissues of each group(×200)

Notes A: sham group at 2 weeks time point; B:UUO group at 2 weeks time point; C:UUO group at 4 weeks time point; D: Quinapril group at 2 weeks time point; E:Q+UUO group at 4 weeks time point. TGF-β1protein was mainly expressed in tubular cells, and also found in interstitium of kidney at 4 weeks time point afer UUO operation. More positive staining of TGF-β1protein was detected in UUO group than quinapril group

圖4 各組大鼠腎組織α-SMA的表達(免疫組化，×200)

Fig 4 Expression of α-SMA immunohistochemically in renal tissues of each group(×200)

Notes A: sham group at 2 weeks time point; B:UUO group at 2 weeks time point; C:UUO group at 4 weeks time point; D: Quinapril group at 2 weeks time point; E:Quinapril group at 4 weeks time point. α-SMA was expressed mainly in interstitium and small vessles. α-SMA positive staining was much stronger in UUO group than quinapril group

3 討論

自20世紀80年代中期以來，動物實驗已證實ACEI比其他類降血壓藥可更有效地保護腎臟，減輕腎臟損傷。在腎小球腎炎和腎間質纖維化中，不論是否伴有高血壓，均可見腎組織中RAS活性增強。可見AngⅡ不僅通過增加腎小球毛細血管內壓的單一途徑造成腎臟損傷，且據推測AngⅡ具有直接調控多種血管活性因子、細胞因子、生長因子及炎癥細胞的作用[13,14]，但迄今為止其作用機制尚未闡明。

ACEI種類繁多，與貝那普利、雷米普利、培哚普利、依那普利和卡托普利相比較，喹那普利具有最小的半數抑制量(ID50)值，且具有較強的脂溶性和組織親和性，故喹那普利與組織中的血管緊張素抑制酶(ACE)親和力極高，ACE抑制作用相對較強[15]。Wadworth等[16]證實喹那普利的不良反應發(fā)生率低于依那普利和卡托普利，同時由于喹那普利不含巰基，故過敏反應及腎毒性均罕見，提示喹那普利具備了高效低毒的特性。

本研究采用經典的慢性腎間質纖維化UUO模型，并選擇長期觀察(梗阻后2和4周)直至終末腎狀態(tài)，觀察隨著腎間質纖維化的進行性加重，可疑致纖維化因子的變化及喹那普利的拮抗作用是否持續(xù)有效。

作為一種多功能的多肽生長因子，TGF-β1是目前公認的最重要的致纖維化關鍵因子之一。如圖1、3所示，TGF-β1廣泛分布于腎小管上皮細胞、間質成纖維細胞和小球系膜細胞的胞質中。UUO組腎小管上皮及間質細胞中TGF-β1分泌明顯活躍，原位雜交結果更明確顯示隨著梗阻時間的延長，TGF-β1mRNA在擴張或萎縮的腎小管上皮細胞及增生的腎間質細胞中表達逐漸增多，提示TGF-β1在UUO所致慢性腎間質纖維化的進程中具有重要的作用。

TGF-β1致纖維化作用的主要環(huán)節(jié)為[17～20]：①激發(fā)小管上皮細胞和間質細胞向成纖維細胞的轉分化；②抑制多種ECM降解酶(如PIA-1和TIMPs等)的活性，發(fā)揮抑制ECM降解的作用；③促進膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ型膠原等)合成，從而刺激ECM沉積；④激活單核/巨噬細胞系統間質浸潤基質蛋白沉積，導致間質纖維化。腎小管上皮細胞和系膜間質細胞發(fā)生表型轉化而成為肌纖維母細胞，而α-SMA陽性標記的肌纖維母細胞喪失上皮黏附性，重新組合肌動蛋白，破壞腎小球基底膜，同時肌纖維細胞可產生大量的Ⅰ、Ⅲ型膠原。因此，腎組織纖維化最顯著的特征是肌纖維母細胞的增生和ECM的過度沉積。

以α-SMA為陽性標記的肌纖維母細胞是產生ECM的主要細胞。本研究結果顯示，UUO組大鼠腎間質細胞呈現α-SMA強陽性染色，且隨著梗阻時間的延長,α-SMA的表達愈加明顯，證實了α-SMA是促進梗阻腎ECM沉積的主要因子或主要因子之一。喹那普利的干預明顯阻抑了肌纖維母細胞的形成，有效減少了ECM的沉積，從而延緩了腎間質纖維化的發(fā)展過程。

有學者提出[21,22]，在治療腎臟疾病時，TGF-β1應被視為除高血壓外的重要的治療靶點。ACEI可能會阻斷AngⅡ誘導的TGF-β1高表達，從而干擾腎纖維化的進程，起到腎保護作用。本研究結果表明喹那普利可明顯抑制UUO大鼠腎組織中TGF-β1mRNA和蛋白水平的表達，使病變腎組織中成纖維細胞明顯減少，進而降低腎間質容量，并通過4周觀察證實了ACEI通過抑制TGF-β1高表達的抗腎纖維化作用在終末期腎臟損害中亦持續(xù)有效。

本研究的不足之處和局限性：①僅對喹那普利拮抗腎纖維化的作用進行了觀察，未與其他ACEI藥物在抑制腎纖維化效應方面進行比較；②對喹那普利通過何種途徑抑制了TGF-β1表達亦未涉及。均有待于進一步的實驗研究。

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