王中秋， 許 林

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，我國肺癌的發(fā)病率和病死率一直呈上升趨勢。傳統(tǒng)觀點認為，腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要機制是致癌因素造成DNA序列變異而導(dǎo)致細胞生長、分化失控。近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)DNA序列以外的調(diào)控機制異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中更為普遍[1]。這種不依賴于DNA序列變化的可遺傳的調(diào)控機制稱為表觀遺傳學(xué)機制，主要包括DNA甲基化修飾、組蛋白修飾、染色體修飾、基因組印跡及microRNA調(diào)控等方式，其中DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最深入的一種機制。DNA甲基化是真核細胞基因組常見的表觀遺傳學(xué)修飾，也是脊椎動物DNA唯一的自然化學(xué)修飾方式，在細胞增殖、分化、發(fā)育、基因印跡等方面起重要作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。目前，腫瘤相關(guān)基因DNA甲基化研究獲得了大量的研究成果，這些結(jié)果不僅對深入理解癌變的分子機制具有重要意義，并且提示DNA甲基化研究對于腫瘤的診斷、治療也具有巨大的應(yīng)用潛力[2]。本文對DNA甲基化在非小細胞肺癌診斷和治療中的研究進展作一綜述。

1 DNA甲基化與腫瘤

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，可能存在于所有高等生物中。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，卻可以調(diào)控基因的表達[3]。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達。

甲基化狀態(tài)的改變是引發(fā)腫瘤的一個重要因素。目前認為在腫瘤細胞基因組中發(fā)生甲基化模式的改變主要有2種模型：(1) 基因組整體甲基化水平降低導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定(如染色體的不穩(wěn)定、可移動遺傳因子的激活、原癌基因的表達)[4]；(2)CpG島局部甲基化水平的異常升高，導(dǎo)致基因的不表達。健康人基因組中，CpG島中的CpG位點通常處于非甲基化狀態(tài)，而在CpG島外的CpG位點則通常甲基化。這種甲基化的形式在細胞分裂的過程中能夠穩(wěn)定保留[5]。當腫瘤發(fā)生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態(tài)，以致染色體螺旋程度增加及抑癌基因表達的丟失。大量報道顯示，抑癌基因的沉默與其啟動子區(qū)域CpG島的異常甲基化直接相關(guān)，如許多細胞生長增殖相關(guān)基因與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的基因啟動子區(qū)域的異常甲基化都與其失活有關(guān)。DNA高甲基化不僅影響基因轉(zhuǎn)錄，還可導(dǎo)致C→T突變。DNA低甲基化則可導(dǎo)致原癌基因活化，增加染色體的不穩(wěn)定性，形成突變熱點。這些都會引起基因功能異常，進而導(dǎo)致細胞生長失控，最終形成腫瘤。由于CpG島的局部高度甲基化早于細胞的惡性增生，因此甲基化的診斷可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測。全基因組的低甲基化可隨著腫瘤發(fā)生而出現(xiàn)，且隨著腫瘤惡性度的增加而顯著，可用于腫瘤的分級。因此，甲基化研究為腫瘤的早期診斷、分類、分級及預(yù)后評估提供了新的依據(jù)。

2 DNA甲基化與非小細胞肺癌早期診斷

目前對非小細胞肺癌的診斷主要依據(jù)臨床癥狀、影像學(xué)檢測和組織病理學(xué)檢查等，但多數(shù)患者臨床癥狀出現(xiàn)較晚，且活體取樣困難，在首次診斷時已呈晚期，治療困難，因此進行無創(chuàng)性早期診斷意義重大。與DNA變異相比，基因甲基化改變常是細胞癌變過程中更為早期的事件，可能在腫瘤早期診斷中具有更大的價值。大多數(shù)腫瘤都有多個獨立的啟動子甲基化事件，因此建立合理的多指標甲基化圖譜能為腫瘤風(fēng)險評估、早期診斷以及腫瘤預(yù)后提供有用信息。針對腫瘤組織的DNA甲基化研究為腫瘤無創(chuàng)性診斷奠定了基礎(chǔ)。由于實體腫瘤取材困難，體液循環(huán)DNA容易獲取，因此在體液中尋找更多的腫瘤特異DNA甲基化分子標志物的研究備受關(guān)注。

2.1 外周血循環(huán)DNA甲基化分析 正常人的外周血循環(huán)DNA來源于白細胞，而腫瘤患者的外周血循環(huán)DNA含有壞死或凋亡的腫瘤細胞、微轉(zhuǎn)移灶或循環(huán)腫瘤細胞的裂解以及增值旺盛的腫瘤細胞所釋放的DNA。已證實，在腫瘤患者血循環(huán)DNA中可檢測到與原發(fā)腫瘤細胞相一致的DNA甲基化變化。在非小細胞肺癌患者外周血中已發(fā)現(xiàn)有超過25種基因的甲基化異常，部分列舉見表1。

表1 非小細胞肺癌患者外周血中DNA甲基化分析

注：MSP：Methylation sensitivie PCR; QMSP：Qantitative MSP; Meth-DOP-PCR：Methylation-degenerate oligonucleotide primed PCR

如CDH13, CDKN2A/p16, DAPK, MGMT, PAX5α PAX5β, RASSF1A等診斷非小細胞肺癌的敏感性為7%～27%[11]。Fujiwara等[10]發(fā)現(xiàn)CDKN2A/P16, DAPK, MGMT, RARB, RASSF1A 5個基因中，任一基因的甲基化水平診斷非小細胞肺癌的敏感性僅約49.5%，特異性為85.0%。而聯(lián)合檢測多個基因可顯著提高敏感性。Hsu等[7]聯(lián)合檢測了CDH13, CDKN2A/p16, FHIT, RARB, RASSF1A和ZMYND10，發(fā)現(xiàn)其中任何2個基因甲基化即判斷為陽性，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)診斷敏感性為73%，特異性為82%，較單一指標顯著提高。此外，外周血中CDKN2A甲基化檢測聯(lián)合微衛(wèi)星分析的敏感性增加到62%, CDKN2A 甲基化檢測聯(lián)合循環(huán)DNA水平的特異性可增加到80%[8]。這些研究表明，聯(lián)合檢測多種基因甲基化水平或聯(lián)合其他分子生物學(xué)方法在非小細胞肺癌的診斷方面具有重要的價值。然而，外周血的檢測也有其局限性，首先從外周血中獲得的腫瘤生物學(xué)特性無器官特異性，上述在非小細胞肺癌中有診斷意義的基因(如APC)在其他腫瘤中也存在。因此，尋找肺癌特殊的基因譜仍是目前研究的方向。其次，隨著對支氣管肺泡灌洗液及痰液研究的深入，研究者們逐漸發(fā)現(xiàn)，基因甲基化的檢出率在后者中顯著增高。

2.2 支氣管肺泡灌洗液DNA甲基化分析 與外周血相比，支氣管肺泡灌洗液更易于獲得肺癌細胞并檢測出肺癌特異性的分子生物學(xué)改變。Ahrendt等[14]首次報道了支氣管肺泡灌洗液DNA甲基化分析對肺癌的診斷價值，發(fā)現(xiàn)19例p16基因高甲基化肺癌患者中，有16例患者的肺泡灌洗液中可檢出相應(yīng)的p16異常甲基化。而Topaloglu等[15]通過對31例肺癌患者肺泡灌洗液中8個基因(CDH1，APC，MGMT，RASSF1A，GSTP1，p16，RAR-beta2和ARF)的甲基化分析，發(fā)現(xiàn)可檢出68%的肺癌患者。Belinsky等[16]的研究也顯示支氣管肺泡灌洗液DNA甲基化分析用于肺癌診斷具有比血清更高的敏感性。

2.3 痰液DNA甲基化分析 咳嗽、咳痰是非小細胞肺癌患者的常見癥狀之一。痰液作為一種特殊的體腔積液，比血液、支氣管灌洗液更易于收集。此外，痰液在吸煙人群中的產(chǎn)生率遠遠高于非吸煙人群，因此痰液檢測所提供的分子生物學(xué)信息有利于在高危人群中開展疾病篩查。Palmisano等[17]發(fā)現(xiàn)檢測痰液CDKN2A/P16和(或)MGMT的啟動子甲基化狀態(tài)改變可比臨床最終診斷為非小細胞肺癌早3年。Belinsky等[16]檢測了72例非小細胞肺癌Ⅲ期患者痰液中的8個基因(p16, MGMT, RASSF1A, DAPK, PAX5 α, PAX5 β, H-cadherin, GATA5)的甲基化狀態(tài)，并與各自腫瘤組織和血液中的甲基化狀態(tài)相比較發(fā)現(xiàn)，p16、DAPK、PAX5 β、GATA5等4個基因的陽性預(yù)測率為44%～72%，陰性預(yù)測率≥70%。上述4個基因聯(lián)合檢測的陽性預(yù)測率高達86%。與相應(yīng)的血清相比，痰液中DNA甲基化分析用于肺癌診斷的敏感性更高。上述研究表明，痰液中DNA甲基化的檢測對晚期非小細胞肺癌的診斷，尤其是對不能手術(shù)無法獲得組織標本的患者，有著重要的意義。

3 DNA甲基化與非小細胞肺癌的治療

與遺傳學(xué)改變不同，表觀遺傳修飾是可逆的，使其成為潛在的疾病治療靶點[18]。由于在腫瘤形成過程中，DNA 上的多個基因位點發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致腫瘤抑制因子等重要基因失活。因此，通過DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑抑制特定位點上的甲基化可以糾正錯誤的甲基化修飾，進而直接改變基因表達。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可分為核苷類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和非核苷類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，其中核苷類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑包括5-氮胞嘧啶及其衍生物，非核苷類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑包括多酚-表沒食子兒茶酚-3-沒食子鹽(EGCG)和RG108[19]。其中，研究得最多的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑是5-氮雜-2′-脫氧胞苷酸(5-aza-dC, decitabine，地西他濱)，在進入DNA后，與DNMT1 形成永久共價鍵，從而導(dǎo)致DNMT1的降低，DNA復(fù)制中DNMT1的缺少最終引起甲基化程度降低，低劑量持續(xù)給藥可以獲得癌細胞去甲基化的最大效果[20]。其主要副作用是骨髓抑制。地西他濱可以將沉默的腫瘤抑制因子激活，組蛋白脫乙?；敢种苿?LAQ824(LAQ)可以將細胞周期停止的基因激活，兩者聯(lián)合使用可以協(xié)同產(chǎn)生更大的抗腫瘤效果。該結(jié)果已經(jīng)在乳腺癌和骨髓惡性病變中證實[21]，并正在開展肺癌的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗。然而，Stresemann 等[22]分析比較了6種常見的DNA 甲基化抑制劑，發(fā)現(xiàn)這些DNA 甲基化抑制劑具有很強的去甲基化效應(yīng)，但其伴有較強的細胞毒性，在作用位點選擇上也缺乏特異性。因此，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑的臨床應(yīng)用仍需進一步研究。

4 DNA甲基化的檢測方法

近15年來，人們越來越認識到DNA甲基化研究的重要性，開發(fā)出一系列檢測DNA的方法。根據(jù)研究目的將這些方法分為：基因組整體水平的甲基化檢測、特異位點的甲基化檢測和新甲基化位點的尋找。根據(jù)研究所用的處理方法不同分為：基于PCR的甲基化分析方法、基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法、基于重亞硫酸鹽的甲基化分析方法和柱層法等。

常用的DNA甲基化檢測方法：(1)亞硫酸氫鈉-測序法，是反映基因組甲基化狀態(tài)的最直接、最可靠的方法。測序法以CpG島兩側(cè)不含CpG點的一段序列為引物配對區(qū)，能夠同時擴增出甲基化和未甲基化序列。缺點在于費時且耗資過多，并至少要測序10個以上的克隆才能獲得可靠數(shù)據(jù)。(2)亞硫酸氫鈉-限制性酶切法(combined bisulfite restriction analysis recovery assay，COBRA)，引物設(shè)計與測序法相同, ssPCR 擴增經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾的DNA樣品中特定序列，用限制性內(nèi)切酶識別序列中包含CpG的酶切位點。COBRA在檢測完全甲基化和完全不甲基化的樣品最常用。(3)MSP方法，原理是首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未甲基化的C都被轉(zhuǎn)化為U，而甲基化的胞嘧啶則不變。然后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物并進行PCR擴增。MSP是目前最敏感的甲基化檢測技術(shù)，能發(fā)現(xiàn)0.1%甲基化DNA (50 pg)。(4)實時熒光PCR法(QMSP)，是基于甲基化特異性探針的Taq酶方法檢測甲基化。(5)甲基化敏感的單一核苷酸引物延長法(Ms-SNuPE)，用于定量分析CpG點的甲基化差異。

研究甲基化的方法之多，一方面說明了甲基化研究難度大，另一方面說明這些方法都存在著一定缺陷。面對具體問題，選擇最合適的解決方法就顯得尤為重要。首先，根據(jù)研究目的選擇合適方法：是研究整體水平的甲基化還是特定位點的甲基化，或是要發(fā)現(xiàn)全基因組中新的甲基化位點；其次，根據(jù)客觀條件篩選方法，如：目標的序列是否已知，是定量研究還是定性研究，樣本來源及數(shù)量如何，是否需要高通量的樣本檢測方法；最后，全面分析，選取敏感、可靠、經(jīng)濟、簡便的方法，以達到理想的效果。

5 問題與展望

表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤形成過程中起著重要的作用，可以導(dǎo)致相關(guān)的多個基因失活和功能障礙。研究已經(jīng)充分證明在非小細胞肺癌發(fā)生和發(fā)展的過程中存在著一系列甲基化水平的改變，因此可以通過多種甲基化標志物檢測進行肺癌的早期診斷。利用DNA甲基化特異性PCR、RT-PCR、核酸定量分析和基因芯片等技術(shù)，對基因組范圍內(nèi)的甲基化進行檢測，可能是非小細胞肺癌和其他腫瘤分子檢測的發(fā)展方向。此外，由于基因啟動子等區(qū)域的高甲基化是可逆的，通過去甲基化藥物處理可以使其恢復(fù)表達，有可能為肺癌的治療提供新的思路。

盡管過去數(shù)年利用DNA甲基化檢測進行非小細胞肺癌的診治已取得令人矚目的進步，但這些研究仍限于實驗室中。目前對DNA甲基化調(diào)節(jié)基因表達的復(fù)雜性仍然知之甚少。DNA異常甲基化在腫瘤形成機制中的確切作用尚不清楚，進一步探討抑癌基因甲基化與肺癌的早期發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，了解DNA甲基化如何建立和維持的機制等，有助于闡明肺癌形成的原因。針對DNA甲基化的靶向治療藥物的研究，將為非小細胞肺癌的治療提供新的希望。因此，對非小細胞肺癌相關(guān)抑癌基因異常的甲基化研究有助于腫瘤的早期診斷并推動病因、發(fā)病機制、轉(zhuǎn)歸、治療及預(yù)后的研究。

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