劉振芳， 劉宏斌， 韓曉鵬， 蘇 林， 魏登文

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，胃癌的微轉(zhuǎn)移與其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后均密切相關(guān)。微轉(zhuǎn)移目前尚無統(tǒng)一的定義，一般是指非血液系統(tǒng)的惡性腫瘤在發(fā)展過程中，播散并存活于淋巴系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、骨髓、肝、胰等組織器官中的微小腫瘤細胞。這些細胞尚未形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，常規(guī)病理檢查(如HE染色)難以發(fā)現(xiàn)，一般無任何臨床表現(xiàn)，但微小的腫瘤細胞會迅速生長成為新的轉(zhuǎn)移灶[1-2]。胃癌術(shù)后療效失敗的主要原因為腹膜轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，自1987年腹腔鏡應(yīng)用于膽囊切除術(shù)以來，由于其微創(chuàng)優(yōu)點，應(yīng)用范圍已逐漸擴展到外科的各個領(lǐng)域。腹腔鏡下胃癌根治術(shù)能否達到根治要求，術(shù)中是否造成癌細胞脫落，尚存在分歧，細胞角蛋白19(cytokeratin,CK19)因其具有嚴(yán)格的上皮組織特異性，局限于胃腸上皮細胞，且?guī)缀跛械奈赴┒济黠@表達并在侵襲、轉(zhuǎn)移、擴散到其他組織器官(包括腹腔沖洗液)過程中始終表達，已經(jīng)成為眾多研究胃腸道惡性腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測指標(biāo)之一[3-4]。本研究通過檢測50例胃癌患者手術(shù)前后腹腔沖洗液中CK19表達的情況，分析CK19與腫瘤組織分化程度、TNM分期的關(guān)系，并探討腹腔鏡胃癌根治術(shù)對腹膜微轉(zhuǎn)移的影響。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選擇2008年7月至2009年10月我科收治的經(jīng)病理確診的50例胃癌患者為研究對象，分為開腹組及腹腔鏡組。開腹組采用傳統(tǒng)方法開腹行胃癌根治術(shù)，共有患者29(男15，女14)例，年齡30～81(平均59)歲；高中分化腺癌21例，低分化腺癌8例；pTNM分期Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ期7例。腹腔鏡組在腹腔鏡輔助下行胃癌根治術(shù)，患者21(男13，女8)例，年齡33～70 (平均51)歲；高中分化腺癌14例，低分化腺癌7例；pTNM分期Ⅰ+Ⅱ期12例，Ⅲ期 9例。另選擇同期胃良性疾病接受手術(shù)的患者10(男6，女4)例，年齡18～45(平均34)歲，作為正常對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)均按國際抗癌聯(lián)盟(UICC，2002)公布的臨床病理分期標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均無遠處轉(zhuǎn)移，無化療和免疫藥物治療史，具備手術(shù)指征，可獲根治性切除。腹腔鏡組先建立人工CO2氣腹，常規(guī)探查腹腔內(nèi)臟器，明確無腹內(nèi)臟器轉(zhuǎn)移及腹腔種植。

1.2 標(biāo)本的收集 開腹組在開腹后(簡稱術(shù)前，下同)及消化道重建后(簡稱術(shù)后，下同)，分別于Douglas窩及左膈下置1根16號導(dǎo)尿管，注入150 mL無菌生理鹽水，在不觸動原發(fā)灶的情況下，輕輕攪動后吸出，如有自然腹水則直接吸出(以肝素抗凝)。腹腔鏡組在建立人工氣腹后(術(shù)前)經(jīng)腹部戳孔放入輸尿管，如有腹水直接吸出，如無腹水則經(jīng)導(dǎo)尿管注入無菌生理鹽水150 mL后吸出，另在手術(shù)結(jié)束前(術(shù)后)再次取樣。正常對照組在開腹后同法收集腹腔沖洗液。收集的腹腔沖洗液于1 500 r/min離心5 min后，取沉淀行FCM檢查(前處理和CK19的檢測應(yīng)在6 h內(nèi)完成)。

1.3 流式細胞學(xué)檢測CK19 待檢細胞懸液于300目濾網(wǎng)過濾，調(diào)整細胞濃度至1×106個/mL，分別加入單克隆抗體CK19-FITC(28-MCA1744F)及陰性對照IgG1-FITC(28-MCA928F)(均購自Serotec公司)。詳細操作按說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包，χ2檢驗或確切概率法統(tǒng)計，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前術(shù)后腹腔沖洗液CK19表達情況(表1) 胃癌患者術(shù)前腹腔沖洗液CK19陽性表達率(34.0%，17/50)明顯高于正常對照組(0，0/10)，P<0.05。胃癌患者術(shù)后腹腔沖洗液CK19陽性表達率(38.0%，19/50)較術(shù)前雖有所增加但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。開腹組腹腔沖洗液CK19檢測術(shù)前陽性10例、術(shù)后陽性11例，術(shù)后檢測陽性例數(shù)雖較術(shù)前增加但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。腹腔鏡組腹腔沖洗液CK19檢測術(shù)前陽性7例、術(shù)后陽性8例，術(shù)前與術(shù)后比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。開腹組術(shù)后與腹腔鏡組術(shù)后腹腔沖洗液CK19的檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 術(shù)前術(shù)后腹腔沖洗液中CK19表達的情況

2.2 TNM分期與腹腔沖洗液中CK19表達的關(guān)系 Ⅰ+Ⅱ期患者的CK19陽性表達率，腹腔鏡組術(shù)前(25.0%，3/12)與開腹組術(shù)前(22.7%，5/22)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Ⅲ期患者的CK19陽性表達率，腹腔鏡組術(shù)前(55.6%，5/9)與開腹組術(shù)前(57.1%，4/7)的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。Ⅲ期患者術(shù)前CK19陽性表達率(56.3%，9/16)明顯高于Ⅰ期+Ⅱ期(23.5%，8/34)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 腹腔沖洗液CK19表達與癌組織分化程度的關(guān)系 從表2中可看出在低分化腺癌的腹腔沖洗液中CK19陽性表達率明顯高于高中分化腺癌組(P<0.05)，但手術(shù)前后比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 CK19檢出情況和癌組織分化程度的關(guān)系

3 討論

自1978年腹腔鏡應(yīng)用于膽囊切除術(shù)以來，由于其微創(chuàng)優(yōu)點，應(yīng)用范圍逐漸擴展到外科各個領(lǐng)域。腹腔鏡胃癌手術(shù)和傳統(tǒng)開放胃癌手術(shù)比較，在淋巴結(jié)清掃、腫瘤復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和患者生存率等方面無明顯差異[5]，但手術(shù)操作對腫瘤細胞微轉(zhuǎn)移的影響尚存有爭議。流式細胞術(shù)是一種先進的細胞分析儀，采用計算機、激光和熒光標(biāo)記單克隆抗體技術(shù)，能在短期內(nèi)對大量標(biāo)本進行檢測，具有快速、靈敏的特點?？稍?0個外周血中檢測到1個癌細胞，能快速定量、定性分析細胞，已成為腫瘤研究重要的手段之一，并廣泛應(yīng)用于腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究中[6]。我們的研究顯示腹腔鏡組術(shù)前CK19陽性表達率(0.33%，7/21)較術(shù)后(0.38%，8/21)雖有所增加，但差異無顯著性。開腹組與腹腔鏡組術(shù)后的CK19陽性表達率亦無顯著性差異。Huscher等[7]回顧性研究100例行腹腔鏡胃癌根治手術(shù)患者，其中11例行根治性全胃切除術(shù)，89例行根治性胃部分切除術(shù)，術(shù)后病理分期ⅠA期21例，ⅠB期20例，Ⅱ期17例，ⅢA期17例，ⅢB期5例，Ⅳ期20例，術(shù)中平均清掃淋巴結(jié)35枚，結(jié)果顯示腹腔鏡胃癌根治術(shù)用于治療早期及進展期胃癌安全、有效，能達到胃癌的根治效果。本研究顯示腹腔鏡胃癌根治術(shù)并不增加腹腔微轉(zhuǎn)移的機率，證實在腫瘤的根治性上腹腔鏡手術(shù)和傳統(tǒng)根治手術(shù)一樣可靠。

本研究中胃良性疾病腹腔沖洗液中均無CK19表達，表明CK19具有很高的特異性。同時，胃癌患者腹腔沖洗液中CK19陽性表達與TNM分期呈正相關(guān)，隨著病情的發(fā)展CK19陽性表達率增加。這一結(jié)論與國內(nèi)吳晴等[8]報道基本相符。我們還發(fā)現(xiàn)，腹腔沖洗液中CK19陽性表達率與腫瘤分化程度有關(guān)，低分化組明顯高于高中分化組，顯示CK19作為腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志物其高表達與腫瘤組織的惡性程度相關(guān)。

本研究中胃癌患者術(shù)前腹腔沖洗液中CK19陽性表達率為34.0%，陽性率較低，可能與腹腔沖洗液中腫瘤細胞過少、所納入病例多數(shù)屬Ⅰ、Ⅱ期有關(guān)，我們認為可以通過增大標(biāo)本量和重復(fù)檢測以及規(guī)范操作等方法提高 CK19陽性檢出率和減少假陰性。

綜上所述，通過檢測腹腔沖洗液中CK19表達情況可初步證實腹腔鏡胃癌手術(shù)操作不增加腹腔癌細胞微轉(zhuǎn)移，能夠取得與開腹胃癌根治術(shù)同樣的療效。但關(guān)于腹腔鏡胃癌根治術(shù)的遠期療效還需要回顧性研究、大宗的病例分析及術(shù)后隨訪結(jié)果。

[1] Yokota T, Ishiyama S, Saito T, et al. Lymph node metastasis as a significant prog-nosis factor in gastric cancer: a multiple logistic regression analysis[J].Scand J Gastroenterol, 2004, 39(4):380-384.

[2] Hartgrink HH, Jansen EPM, vanGrieken NCT, et al. Gastric cancer[J].Lancet,2009, 374(9688):477-490.

[3] Chen XM, Chen GY, Wang ZR, et al. Detection of micrometastasis of gastric carcinoma in peripheral blood circulation[J]. World J Gastroenterol, 2004,10(6):804-808.

[4] Osaka H, Yashiro M, Sawada T, et al. Is a lymph node detected by the dye-guided method a true sentinel node in gastric cancer?[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10 (20)：6912-6918.

[5] 詹文華, 韓方海, 何裕隆, 等. 進展期胃癌腹主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律及其清掃對臨床結(jié)局的影響[J]. 中華胃腸外科雜志,2006, 9(1)：17-22.

[6] 周麗, 周振英. 流式細胞儀研制的技術(shù)進展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)儀器與應(yīng)用, 2003, 15(1): 11-17.

[7] Huscher CG, Mingoli A, SgarzIni G, et al. Totally laparoscopic total and subtotal gastrectomy with extended lymph node dissection for early and advanced gastric cancer: early and long-term results of a 100-patient series[J]. Am J Surg, 2007, 194 (6): 839-844.

[8] 吳晴, 李達, 彭志海,等. 檢測胃癌患者腹腔沖洗液CK19 mRNA和CEA mRNA用于預(yù)測腹膜微轉(zhuǎn)移[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2005, 26(5): 492-495.