李成龍，屠偉峰，張 偉，陳曉東

1.廣東省第二中醫(yī)院麻醉科(廣東 廣州 510095) 2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院全軍臨床麻醉中心(廣東 廣州 510010) 3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科(廣東 廣州 510010)

阿片肽是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道中廣泛存在的一種重要的腦腸肽，它對胃腸道的動力、酸分泌、水電解質(zhì)轉(zhuǎn)運等具有多重影響。阿片肽及阿片受體對不同類型的胃粘膜損傷模型有著不同的影響，保護作用和惡化作用均有報道[1～6]，這些研究結(jié)果的分歧可能與不同類型模型的胃粘膜損傷機制的差異有關(guān)系。故本研究采用免疫組織化學技術(shù)(Immunohistochemistry, IHC)，對mu-阿片受體(MOR)、kappa-阿片受體(KOR)、delta-阿片受體(DOR)在大鼠胃組織的分布進行定位分析，探討阿片受體在胃發(fā)揮各種生物學功能及胃粘膜的損傷、修復與再生中的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器主要試劑 兔抗MOR多克隆抗體(Chemicon公司，美國)，兔抗DOR多克隆抗體(Chemicon公司，美國)，兔抗KOR多克隆抗體(Santa cruz公司，美國)，SP試劑盒(廣州深達生物公司)。主要儀器CS-Ⅵ型攤片烤片機(孝感巿宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)，BM-Ⅶ生物組織包埋機(孝感巿宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)，石蠟切片機(廣州錦繡儀器公司)，顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.2動物選擇成年雄性Wistar大鼠24只，16～20周，體質(zhì)量200±20 g，南方醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 動物取材 采用頸椎脫臼法處死大鼠，打開腹腔，暴露胃。用細線結(jié)扎賁門與幽門，取胃， 4%多聚甲醛5 ml胃腔注射。10 min后，沿胃大彎剪開平鋪，用冰鹽水沖洗胃腔，剪取胃竇、胃體等處胃組織，大小約為1 cm×1 cm，4%多聚甲醛固定8 h，石蠟包埋備用。

1.3.2 免疫組化染色 切片；蠟筆畫圈；常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水；檸檬酸(pH7.4～7.6)高溫抗原修復20 min；30 ml/L H2O2孵育20 min；滴加1% Triton X-100封閉30 min；滴加一抗(稀釋度1∶500)并4℃過夜；滴加二抗(稀釋度1∶1500)，室溫下孵育60 min；滴加辣根過氧化酶(HRP)標記的鏈酶卵白素，室溫下孵育10 min；每步驟后均經(jīng)0.01 M PBS沖洗5 min×3次；蘇木素復染；脫水、透明、封片。用PBS液代替一抗做陰性對照，步驟同前。

2 結(jié)果

2.1阿片受體在胃組織各部位的陽性反應(yīng)程度見表1。

2.2正常胃組織HE染色圖A為胃粘膜層(HE×200)，黑色箭頭部分為胃粘膜粘液層及上皮層；圖1B為胃粘膜腺體區(qū)(HE×200)，黑色箭頭部分為壁細胞，光鏡下可見壁細胞，細胞膜邊界明顯，胞漿呈嗜酸性，HE染色呈淡紅色，壁細胞周圍為主細胞；圖1C為胃粘膜肌層(HE×400)，肌間神經(jīng)叢分布于縱形肌與橫行肌交界處。黑色箭頭部分為肌間神經(jīng)叢，光鏡下神經(jīng)元細胞核大而不規(guī)則，可見核仁。圖1見封三。

表1 胃組織μ-、δ-、κ-阿片受體陽性反應(yīng)顆粒的分布

注：-陰性反應(yīng)，+輕度陽性反應(yīng)，++中度陽性反應(yīng)，+++重度陽性反應(yīng)

2.3 mu-阿片受體在胃組織的分布MOR免疫反應(yīng)陽性棕色顆粒主要分布于胃粘膜粘液層及上皮細胞層(圖2A圖黑色箭頭)、胃主細胞的胞膜及胞漿(圖2B圖黑色箭頭)、胃粘膜下肌間神經(jīng)叢(圖2C圖黑色箭頭，圖2見封三。)。

2.4 kappa-阿片受體在胃組織的分布KOR免疫反應(yīng)陽性棕色顆粒主要分布于胃主細胞的胞膜及胞漿(圖3B圖黑色箭頭)、胃粘膜下肌間神經(jīng)叢(圖3C圖黑色箭頭)，而胃粘膜粘液層及上皮細胞層KOR免疫反應(yīng)呈陰性。圖3見封三。

2.5 delta-阿片受體在胃組織的分布DOR免疫反應(yīng)陽性棕色顆粒主要分布于胃主細胞的胞膜及胞漿(圖4B圖黑色箭頭)、胃粘膜下肌間神經(jīng)叢(圖4C圖黑色箭頭)，而胃粘膜粘液層及上皮細胞層DOR免疫反應(yīng)呈陰性。圖4見封三。

3 討論

阿片肽與阿片受體作用可引起細胞膜的超極化和降低膽堿能快興奮性突觸后電位的幅度，通過阻斷動作電位的傳導或引起突觸前抑制以減少Ach的釋放。阿片肽對胃腸道功能有多重影響，如胃腸動力、酸分泌、水電解質(zhì)轉(zhuǎn)運等。然而，阿片類藥物及阿片肽對不同類型的胃粘膜損傷有著不同的影響，保護作用和惡化作用均有報道[1～6]，這表明阿片肽及阿片類藥物對胃黏膜的保護與損害作用取決于阿片受體在胃組織各層功能細胞上的分布及其阿片肽對胃組織細胞功能的影響。

本研究顯示，mu-阿片受體陽性顆粒主要分布于胃黏膜上皮及黏液層、胃主細胞、肌間神經(jīng)叢這些區(qū)域，且主要表達在胞漿和胞膜，這似乎表明阿片肽可以通過阿片受體抑制胃黏膜表層黏液的分泌、抑制胃蛋白酶的分泌、影響胃平滑肌的緊張性和收縮頻率。Del Tacca M[2]等人的研究發(fā)現(xiàn)，腹腔給予morphine能劑量依賴性抑制胃分泌液的容量、酸度、胃蛋白酶的產(chǎn)量和胃結(jié)合粘蛋白數(shù)量，而morphine對胃潰瘍的影響是非劑量依賴性的，腹腔5 mg/kg的劑量能顯著增加胃損害，腹腔給予Naloxone能預(yù)防m(xù)orphine對胃分泌液的容量、酸度、胃蛋白酶產(chǎn)量的影響，但對為粘液和潰瘍評分沒有影響，腦室給予morphine能劑量依賴性抑制胃分泌液的容量、酸度和胃潰瘍評分，而對胃粘液沒有影響，腦室給予Naloxone則能預(yù)防m(xù)orphine上述效應(yīng)，這些研究結(jié)果表明morphine對胃分泌抑制效應(yīng)是通過中樞和外周機制來實現(xiàn)的，而對粘液的影響則是通過外周阿片受體作用來抑制其合成，并且屏障粘液合成的抑制可能部分參與了morphine致潰瘍作用。然而，Tazi-Saad & Del Tacca等[3]人的研究結(jié)果則得出上述相反的結(jié)果。他們研究了morphine對indomethacin、aspirin、taurocholic acid 三種藥物復制的大鼠胃潰瘍動物模型幽門結(jié)扎后胃分泌、粘液屏障、粘摸損傷的影響。結(jié)果顯示：三種致潰瘍藥物誘導明顯的胃粘膜損傷，morphine減少胃酸分泌并抑制aspirin、taurocholic acid誘導的粘膜損傷，對indomethacin誘導的損傷沒有影響，提示indomethacin與aspirin 、taurocholic acid致潰瘍機制不同，而且morphine是通過增加粘液屏障的厚度來發(fā)揮抗?jié)冏饔玫?，且增加的厚度值與它的保護效應(yīng)正相關(guān)，其保護效應(yīng)能被naloxone逆轉(zhuǎn)。由此可見，mu-阿片受體在胃組織各功能細胞的分布決定了它的生理功能，并與細胞的所處的功能狀態(tài)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)delta-與kappa-阿片受體在胃黏膜上皮及黏液層沒有陽性顆粒的表達，只分布于胃主細胞、肌間神經(jīng)叢這些區(qū)域。delta-與kappa-阿片受體對胃腸道功能影響的研究尚不多見，Gyires K等[1]人2001年研究了δ阿片受體選擇性激動劑DADLE、DPDPE、deltorphin II和mu-受體選擇性激動劑DAGO對乙醇誘導大鼠胃粘膜損傷的保護作用，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周delta-和mu-阿片受體介導胃粘膜保護，阿片受體胃粘膜保護作用需要迷走神經(jīng)完整性，NO和PGs參與了阿片受體介導的胃保護。我們的前期研究結(jié)果也表明，舒芬太尼可通過抗氧自由基機制對大鼠急性胃黏膜病變發(fā)生保護作用，其可能與delta-、kappa-阿片受體有關(guān)[7]。delta-與kappa-阿片受體在胃腸道中的生理功能及相互之間的作用需進一步深入研究。

在本實驗中值得注意的是，mu-、delta-、kappa-三種阿片受體在黏膜下神經(jīng)叢為陰性表達。黏膜下神經(jīng)叢支配黏膜下血管，而黏膜下血管的收縮影響胃黏膜血流量(GMBF)，而GMBF是胃黏膜保護與損傷重要的調(diào)控靶點之一。近年來，本研究領(lǐng)域鮮有阿片類藥物對GMBF影響的文獻報道，從本實驗結(jié)果似乎可以看出mu-、delta-、kappa-三種阿片受體對GMBF沒有直接影響，它們可能通過對組織局部NO和PGs含量的影響來間接調(diào)節(jié)GMBF，但阿片肽對NO和PGs組織含量的影響機制尚不明了。

總之，mu-、kappa-、delta-阿片受體在胃主細胞膜和胞漿、肌間神經(jīng)叢等部位均有分布，但僅mu-阿片受體存在于胃黏膜上皮及黏液層，提示阿片受體參與了胃各種生物學功能及胃粘膜的損傷、修復與再生，其確切機制尚有待于進一步研究。

[1] Gyires K, Ronal AK.Supraspinal δ- and μ-Opioid Receptors Mediate Gastric Mucosal Protection in the Rat[J].J Pharmacol Exp Ther,2001,297(3):1 010-1 015.

[2] Del Tacca M,Bernardini C,Corsano E,et al.Effects of morphine on gastric ulceration, barrier mucus, and acid secretion in pylorus-ligated rats[J].Pharmacology,1987,35(3):174-180.

[3] Tazi-Saad K,Chariot J,Vatier J,et al.Antisecretory andanti-ulcer effects of morphine in rats after gastric mucosal aggression[J].Eur J Pharmacol,1991,192(2):271-277.

[4] Bhounsule SA, D′Souza RS, Dhume VG. Gastric cytoprotective effect of morphine is probably not mediated by mu-receptors[J].Arch Int Pharmacodyn Ther,1994,328(1):99-105.

[5] 黎家華，石新蘭，唐英卿.多個免疫組化指標檢測效果的方法探討[J].湖北民族學院學報(醫(yī)學版)，2002，19(2)：58-59.

[6] Gyires K, Rónai AZ,Tóth G, te al. Analysis of the role of delta opioid receptors in gastroprotection in the rat[J].Life Sci,1997,60(16):1 337-1 347.

[7] 李成龍, 屠偉峰,丁東.舒芬太尼預(yù)處理對大鼠急性胃黏膜病變組織中MDA與SOD的影響[J].廣東醫(yī)學,2008,29(9):1 463-1 465.