龔張斌,金國琴

(上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,上海 201203)

胸腺衰老被認為是機體衰老的“指示燈”。自然衰老大鼠 HPA軸功能慢性亢進,血皮質(zhì)酮濃度異常升高,病理濃度的皮質(zhì)酮能阻滯細胞周期于 G1期,抑制細胞增殖,推測其也是引起胸腺萎縮、免疫功能減退、加速機體衰老的重要機制。應用補腎藥物能延緩此過程,但具體機制仍不明了。本文模擬老年大鼠的高皮質(zhì)酮血癥,制作大鼠擬“衰老”胸腺細胞模型,從胸腺細胞增殖、周期和免疫功能角度,進一步探討左歸丸延緩胸腺依賴性免疫功能下降的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24h SD乳鼠,160g±10g SD雄性大鼠,清潔級。上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,動物許可證號SCXK(滬 )2008-0016。

1.2 主要儀器和試劑

RealPlex4型熒光定量 PCR儀(Eppendorf CO.,LTD)等。

1.3 大鼠血清的制備及方藥組成

左歸丸:熟地 24g,山藥 12g,枸杞 12g,山茱萸12g,川牛膝 9g,菟絲子 12g,鹿角膠 12g,龜膠 12g。選用 160g±10g SD大鼠,分左歸丸組和空白血清組,按文獻方法制備含藥大鼠血清。

1.4 胸腺基質(zhì)液的制備

無菌條件下,取 24h新生乳鼠胸腺,按文獻方法培養(yǎng)胸腺基質(zhì)細胞,待細胞長滿培養(yǎng)板孔的 80%后,完全換液,繼續(xù)培養(yǎng) 48h,收集培養(yǎng)上清液,0.22μm濾器過濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 原代培養(yǎng)胸腺細胞

制備胸腺單細胞懸液。應用大鼠淋巴細胞分離液分離淋巴細胞,2500r/min離心 10min,取中層淋巴細胞,PBS洗滌。取單細胞懸液接種于 6孔培養(yǎng)板,接種細胞量為 5×105個 /ml,置 37℃5%CO2培養(yǎng)箱里孵育。24h后洗滌細胞,進行后續(xù)實驗。

1.6 分組及藥物處理

分組:(1)正常對照組:含 15%大鼠空白血清;(2)皮質(zhì)酮處理組(簡稱模型組):含 1×10-5M皮質(zhì)酮藥液,15%大鼠空白血清;(3)皮質(zhì)酮加左歸丸血清組(簡稱左歸組):含 1×10-5M皮質(zhì)酮藥液,15%大鼠左歸丸藥物血清。以上各組均含 40%胸腺基質(zhì)液。各組在藥物處理 48h后均加入 ConA,終濃度為 5μg/ml,繼續(xù)培養(yǎng) 48h。其中,在胸腺細胞增殖檢測實驗中增設 1組;(4)空白組:含 15%大鼠空白血清,40%胸腺基質(zhì)液,不加 ConA。

1.7 MTT法檢測胸腺細胞增殖

于 96孔細胞培養(yǎng)板每孔中加入 MTT試劑(5mg/ml)20μl,繼續(xù)培養(yǎng) 4h,2500r/min離心 6min,棄上清加入 150μl DMSO,振蕩 10min,酶標儀測定570nm的 OD值。

1.8 PI染色分析細胞周期分布及流式細胞儀分析

根據(jù)試劑盒實驗方法,細胞固定、染色行 FCM分析。激發(fā)波長 Ex=488nm,發(fā)射波長 Em=530nm。每管樣品檢測 10000個細胞,全部數(shù)據(jù)經(jīng)Beckman流式細胞儀自帶軟件獲取和分析。

1.9 胸腺細胞各種目的基因 mRNA表達檢測

Trizol Reagent抽提 Total RNA。合成 cDNA進行 qRT-PCR反應。p16引物如下:上游引物:5'-ATGAGTTGGGAGGAGGCAGG-3',下游引物:5'-CGGCGTTTGGAGTGGTAGAA-3'。cdk4引物:上游引物:5'-GATGCTGGAGGTCTGCGAGGAA-3',下游引物:5'-AGAGGCCACGAACATGCAAGT-3'。IL-2引物:上游引物:5'-GCCTCCTACTTATAACACACA-3',下游引 物:5'-CCTTGGGGCTTACAAAAAGAA-3'。內(nèi)參GAPDH引物:上游引物:5'-GGTATCGTGGAAGAACTCATGAC-3',下游引物:5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAC-3'。擴增條件:94℃變性 30s,62℃退火 30s,72℃延伸 30s,共30個循環(huán)。通過 RNA瓊脂糖凝膠電泳對 PCR產(chǎn)物進行鑒定。采用 SYBR Green熒光定量 PCR試劑盒,取各組 cDNA模板,利用 RealTime-PCR檢測目的mRNA的 Ct值。反應體系為:2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5μl,Forward primer(10μmol/L)1μl,Reverse primer(10μmol/L)1μl,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(0.2μg)5μl,DEPC-ddH2O加至 25μl混勻 ,取 20μl加入 PCR管中。最佳反應條件為:95℃ 2min,95℃15s,60℃ 25s,72℃ 45s,共 40個循環(huán)。每組待測樣本均設立 6個重復,全部反應結束之后,mRNA的變化值按公式:化值按公式:進行計算。

1.10 Western blotting法檢測胸腺細胞各種目的蛋白表達水平

洗滌,細胞離心,利用蛋白抽提液提取細胞總蛋白,應用改良 Bradford法進行定量。取 2μl相同濃度的蛋白進行 SDS-PAGE電泳,利用半干轉(zhuǎn)移電泳槽將膠上蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF膜,封閉加一抗,4℃過夜,PBST漂洗 4次,二抗孵育,37℃搖床 45min,PBST漂洗 4次。利用 ECL kit檢測目標條帶,X-光片壓片、定影、顯影。成像系統(tǒng)拍片、掃描,待分析。

1.11 數(shù)據(jù)分析

2 結果

2.1 各組胸腺細胞的增殖變化

與空白組比較,加入 ConA后正常對照組胸腺細胞 OD值顯著升高。與正常對照組比較,1×10-5M皮質(zhì)酮處理的模型組細胞 OD值顯著降低;與模型組比較,左歸組細胞 OD值顯著升高。

表1 各組胸腺細胞的增殖變化

表1 各組胸腺細胞的增殖變化

注:與空白組比較:P<0.05,P<0.01;與正常對照組比較:P<0.05,P<0.01;與模型組比較:＊P<0.05,＊＊P<0.01(下同)

組 別n OD570細胞培養(yǎng)0h 細胞培養(yǎng) 120h空 白 組 6 0.618±0.03 0.108±0.02正常對照組 6 0.610±0.04 0.621±0.05模 型 組 6 0.616±0.03 0.260±0.02左 歸 組 6 0.605±0.04 0.498±0.03＊＊

2.2 各組胸腺細胞周期的變化

圖1顯示,與正常對照組比較,模型組胸腺細胞阻滯于 G1期的細胞數(shù)量顯著升高(P<0.01),G2期細胞數(shù)量顯著下降,但 S期細胞數(shù)量無明顯差異(P>0.05)。與模型組比較,左歸組胸腺細胞處于G1期的數(shù)量顯著減少,處于S期細胞數(shù)量升高(P<0.05),G2期細胞數(shù)量無明顯差異。

2.3 各組胸腺細胞各種目的基因 mRNA表達的變化

2.3.1 qRT-PCR條件的優(yōu)化 圖2為RealTime-PCR反應得到反映核酸擴增過程的標準曲線。從圖2可見,相關系數(shù)(R2)及擴增效率分別為 0.996、98%,復孔的重復性好,證明加樣的誤差小。熔解曲線為單一峰,證實了產(chǎn)物的特異性。擴增曲線呈 S形,符合熒光實時定量 PCR實驗優(yōu)化指標。

2.3.2 各組胸腺細胞目的基因 mRNA表達的變化 與正常對照組比較,模型組胸腺細胞 p16 mRNA表達顯著升高 cdk4,IL-2 mRNA表達明顯降低。與模型組比較,左歸組 p16 mRNA表達明顯降低,IL-2 mRNA表達顯著上升,cdk4 mRNA表達無統(tǒng)計學差異。

表2 各組胸腺細胞目的基因 mRNA表達的變化

表2 各組胸腺細胞目的基因 mRNA表達的變化

組 別 n p16/GAPDH cdk4/GAPDH IL-2/GAPDH正常對照組 6 1.000±0.01 1.000±0.01 1.000±0.05模 型 組 6 3.192±0.13 0.769±0.130.653±0.03左 歸 組 6 1.990±0.12＊＊ 0.828±0.19 1.521±0.05＊＊

2.4 胸腺細胞各種目的蛋白表達的變化

與正常對照組比較,模型組細胞 p16蛋白表達顯著升高,CDK 4、IL-2、IL-2Rα蛋白表達降低。與模型組比較,左歸組細胞 p16蛋白表達顯著降低,IL-2、IL-2Rα蛋白表達顯著升高,CDK4蛋白表達有升高趨勢,但無統(tǒng)計學差異。

表3 各組胸腺細胞目的蛋白表達的變化

表3 各組胸腺細胞目的蛋白表達的變化

組 別 n p16/GAPDH CDK4/β-actin IL-2/GAPDH IL-2Rα/β-actin正常對照組 6 0.509±0.19 0.783±0.11 0.714±0.10 0.813±0.12模 型 組 6 1.887±0.42 0.677±0.05 0.482±0.08 0.368±0.16左 歸 組 6 0.946 ±0.20＊＊ 0.694±0.08 0.784±0.11＊＊ 0.634±0.08＊＊

圖1 各組胸腺細胞周期的變化

圖2 GAPDH基因標準曲線

圖3 各組胸腺細胞目的蛋白表達變化的Western blot圖

3 討論

細胞衰老表現(xiàn)為增殖能力下降,生長不可逆停滯。細胞增殖能力的關鍵是順利通過細胞周期各個控制點。不同細胞周期受不同亞型細胞周期素及周期素依賴型蛋白激酶控制,從而表現(xiàn)出不同的增殖刺激因素易感性。胸腺細胞增殖能力與胸腺依賴性免疫功能關系密切,免疫功能可由胸腺細胞分泌細胞因子的能力來評價,反之細胞因子的分泌合成也調(diào)節(jié)胸腺細胞的增殖過程。IL-2放大 IL-2R基因的表達,后者通過蛋白酪氨酸激酶(PTK)通路,最終活化 CDK并激活周期素 E,調(diào)節(jié)胸腺細胞生長發(fā)育,激活胸腺細胞從 GO進入 G1期從而增殖。

G1期限制點是真核細胞接受外界增殖和抑制增殖信息的重要調(diào)控點。實驗結果表明,應用 1×10-5M皮質(zhì)酮直接作用于胸腺細胞后,細胞顯著阻滯于 G1期,G2期細胞數(shù)量顯著下降,出現(xiàn)細胞衰老的變化特點。p16-CyclinD/CDK4-pRb通路中各基因的表達及功能的改變可能是決定細胞衰老進程的最重要因素。實驗發(fā)現(xiàn),經(jīng)皮質(zhì)酮作用后,胸腺細胞p16基因的表達顯著升高,CDK4表達明顯降低,以致細胞停滯于 G1期。IL-2是誘導 T細胞活化最重要的細胞因子,IL-2含量下降又是胸腺細胞衰老的結果。IL-2與高親和力 IL-2R的相互作用在免疫系統(tǒng)發(fā)育和調(diào)節(jié)淋巴細胞免疫中起著關鍵作用。IL-2R的 a亞單位即 CD25分子,是 T細胞中期活化的標志。在 ConA刺激下,皮質(zhì)酮顯著降低胸腺細胞IL-2、IL-2Rα的表達量,說明皮質(zhì)酮能抑制胸腺細胞活化的信號傳導通路,降低胸腺依賴性免疫功能。

應用補腎益氣類方藥調(diào)整胸腺細胞增殖能力,提高胸腺依賴性免疫功能,符合中醫(yī)扶正固本延緩衰老的治則。左歸丸根據(jù)陰陽互根理論,陽中求陰,陰陽并調(diào),為治療腎虛衰老的經(jīng)典方。實驗發(fā)現(xiàn),采用左歸丸含藥鼠血清干預后,G1期細胞數(shù)量下降,S期細胞數(shù)量增加,說明左歸丸血清能一定程度緩解皮質(zhì)酮對胸腺細胞 G1期阻滯的程度,并提示其作用的周期時相可能位于 G1期,從而提高細胞增殖能力。同時發(fā)現(xiàn),p16基因表達有顯著回調(diào),而CDK4表達無統(tǒng)計學差異。由此推測,左歸丸鼠血清主要能通過抑制 p16基因的表達,減輕皮質(zhì)酮對胸腺細胞周期阻滯的作用,從而促進胸腺細胞合成分泌 IL-2,后者又促進和放大 IL-2R基因的轉(zhuǎn)錄和表達,進而延緩胸腺細胞依賴性免疫功能的退化。以上結果表明,皮質(zhì)酮能抑制細胞周期相關蛋白表達,提高凋亡相關蛋白表達,進而導致胸腺免疫功能退化;而左歸丸可通過改善這些調(diào)控蛋白的表達,而影響胸腺細胞的增殖進程,延緩胸腺免疫功能退化。