李靜雯 張正英

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 甘肅 蘭州 730070)

禾谷類作物的遺傳轉(zhuǎn)化現(xiàn)已廣泛用于改良作物品質(zhì)，也是功能基因組學(xué)研究的有力手段[1]。大麥作為世界上第四大糧食作物在全球100多個(gè)國(guó)家廣泛種植。除了其自身的重要研究?jī)r(jià)值，大麥(二倍體)也可作為研究其他遺傳背景更為復(fù)雜的六倍體禾谷類作物(如小麥)的模式作物。因此建立一個(gè)高效、穩(wěn)定的大麥遺傳轉(zhuǎn)化體系是十分必要的。

大麥的遺傳轉(zhuǎn)化始于20世紀(jì)90年代。1994年Wan等利用基因槍介導(dǎo)法獲得了世界上第一例可育轉(zhuǎn)基因大麥[2]。1997年Tingay 等首次建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥幼胚遺傳轉(zhuǎn)化程序，并成功獲得了大麥轉(zhuǎn)基因植株[3]。Trifonova[4]、Wu[5]、Murray[6]、Shrawat[7]、Hensel[8]等相繼報(bào)道了提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大麥頻率的影響因素，如大麥基因型和外植體、菌株和載體、胚的大小及處理方式、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)條件、乙酰丁香酮(AS)的作用、培養(yǎng)基成分等。

雖然以花藥、小孢子、莖端分生組織、原生質(zhì)體及剝離的子房做為轉(zhuǎn)化受體相關(guān)研究也獲得成功[9-12]，但是要獲得較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率，幼胚仍然是首選的轉(zhuǎn)化受體[13]。與基因槍介導(dǎo)法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好，可以導(dǎo)入大片段的DNA等優(yōu)點(diǎn)，而且導(dǎo)入的基因一般為單拷貝整合，獲得的轉(zhuǎn)基因株系其后代基因表達(dá)更穩(wěn)定，且轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象較少[14]。因此本研究以大麥幼胚為轉(zhuǎn)化受體，選擇根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)大麥遺傳轉(zhuǎn)化的幾個(gè)重要影響因素進(jìn)行比較和優(yōu)化，旨在為進(jìn)一步建立大麥幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)大麥基因工程育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料。供試大麥品種Golden Promise由中國(guó)農(nóng)科院品資所提供，Schooner，甘啤4號(hào)，秀81-47，秀麥1號(hào)由甘肅省農(nóng)科院啤酒原料研究所大麥育種組提供，共計(jì)5個(gè)大麥品種。大麥種子播種于大田后進(jìn)行常規(guī)的田間管理。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒。根癌農(nóng)桿菌菌株為C58c1，EHA105。試驗(yàn)所用質(zhì)粒為pVec-8-gus，從澳大利亞引進(jìn)。該質(zhì)粒T-DNA 區(qū)帶有β-葡萄糖苷酸酶( gus) 基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTⅡ)基因，分別由CaMV35S 和Ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。

1.2 試驗(yàn)方法

設(shè)計(jì)了4 種影響因素，分別為預(yù)培養(yǎng)天數(shù)、 侵染時(shí)間、菌液濃度、共培養(yǎng)基等，在這些因素內(nèi)依次設(shè)置 4、 3、 3和 2 個(gè)處理水平。各因素、 各處理包含的個(gè)體數(shù)目不一致，為了分析方便，逐個(gè)比較各因素內(nèi)不同處理水平。

1.2.1 培養(yǎng)基成分。本試驗(yàn)共用6種培養(yǎng)基，其成份見表1。

1.2.2 大麥幼胚的預(yù)培養(yǎng)。大麥開花后12～14d剪下幼穗, 剝出籽粒。70%的酒精表面消毒1min，再用20% 的NaClO消毒8～10min, 無菌水沖洗3～4次。在超凈工作臺(tái)用鑷子剝?nèi)∮着?，去軸后盾片朝上接種于預(yù)培養(yǎng)基，24±1℃暗培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)天數(shù)設(shè)為1d，4d，5d，6d。

表1 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化大麥幼胚所用的培養(yǎng)基成分

1.2.3 農(nóng)桿菌接種菌液的準(zhǔn)備。感染前2～3d 從-70℃冰箱中取出農(nóng)桿菌，在冰上融化后劃線培養(yǎng)，接種于含50mg/L Rif，50mg/L Gta(慶大霉素)或50mg/L Str(鏈霉素)的YEP 固體培養(yǎng)基中，28 ℃，暗培養(yǎng)2～3d，之后挑取單菌落于28 ℃，200 r/min 過夜培養(yǎng)。吸取2 ml 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50 ml 含50 mg/L Gta、50 mg/L Rif 的YEP 培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min 繼續(xù)暗培養(yǎng)至OD600 = 0.6～1.0 。將菌液轉(zhuǎn)至無菌離心管中，5000 r/ min 離心5min；菌體沉淀用侵染培養(yǎng)基洗滌一次后，再用該培養(yǎng)基重懸，使重懸菌液OD600 = 0.3～1.0 。重懸菌液中加入終濃度為200 μmol/L的AS，用于侵染大麥外植體。

1.2.4 大麥幼胚的侵染和共培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)化受體浸入侵染培養(yǎng)基(表1),在24±1℃條件下分別用OD600為0.3，0.6，1.0的菌液分別侵染15min、30min、1h ,用滅菌濾紙吸干后直接轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基，于 24±1 ℃，暗培養(yǎng) 2～3d。

1.2.5 抗性愈傷組織的誘導(dǎo)和選擇。共培養(yǎng)洗菌后的愈傷組織置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基24±1 ℃黑暗培養(yǎng)下恢復(fù)培養(yǎng)5～7d，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)入附加50 mg/L Hyg的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上, 同樣的條件下培養(yǎng)2～4周，篩選出抗性愈傷組織。之后轉(zhuǎn)入附加25 mg/L Hyg的分化培養(yǎng)基進(jìn)行24±1 ℃，16h/8h (光/暗) 光照培養(yǎng)，以篩選抗性芽、苗。

1.2.6 gus檢測(cè)。gus 活性的組織化學(xué)染色檢測(cè)，按 Jefferson 的方法[15]進(jìn)行。共培養(yǎng)后將幼胚或愈傷組織浸泡在1mM的X-Gluc溶液中，37℃下24h，然后換入70%酒精中保存，肉眼或顯微鏡下觀察gus基因表達(dá)情況。

X-Gluc染色液配方中包括38ml 0.2mol/L NaH2PO4, 62ml 0.2 mol/L Na2HPO4, 1ml 0.1 mol/L K3[Fe(CN)6], 1ml 0.1 mol/L K4[Fe(CN)6], 4ml 0.5 mol/L Na2EDTA, 200mg X-Gluc, 50ml 甲醇和120ul Triton-X，定容到250 ml。

gus瞬時(shí)表達(dá)率 = gus瞬間表達(dá)受體組織數(shù)/感染總受體組織數(shù) ×100 %。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)培養(yǎng)天數(shù)對(duì)大麥幼胚根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的影響

影響T-DNA的轉(zhuǎn)移的因素之一在于幼胚轉(zhuǎn)化前的預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間即介于幼胚剝離培養(yǎng)和農(nóng)桿菌侵染幼胚的時(shí)間段。在以往研究[7]基礎(chǔ)上，筆者主要選擇預(yù)培養(yǎng)1d，及4～6d的幼胚作為受體材料進(jìn)行比較。經(jīng)根癌農(nóng)桿菌侵染后取部分材料進(jìn)行g(shù)us瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)。在預(yù)培養(yǎng) 1 d 的幼胚和預(yù)培養(yǎng) 4～6 d的幼胚愈傷組織中均能檢測(cè)到 gus瞬時(shí)表達(dá)(圖1A,B)，但是隨著預(yù)培養(yǎng)天數(shù)的增加，gus基因的瞬時(shí)表達(dá)率顯著下降(表2)。相對(duì)于預(yù)培養(yǎng)4～6d的幼胚，預(yù)培養(yǎng)1d的幼胚gus瞬時(shí)表達(dá)藍(lán)點(diǎn)在盾片的分布區(qū)域更廣。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用預(yù)培養(yǎng)1d的幼胚用于農(nóng)桿菌侵染。

表2 不同預(yù)培養(yǎng)天數(shù)幼胚的 gus瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果

2.2 侵染時(shí)間及菌液濃度對(duì)大麥幼胚根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的影響

以農(nóng)桿菌菌株C58c1/pVec-8-gus感染經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化受體，分別設(shè)計(jì)了幾種不同的菌液濃度及侵染時(shí)間，比較它們對(duì)抗性愈傷組織形成的影響(表3，表4)。由表3結(jié)果可以看出OD600 =0.5時(shí)幼胚抗性愈傷組織獲得率最高，達(dá)22%，遠(yuǎn)高于0.3和1.0。且隨著菌液濃度增大，得到的抗性愈傷組織相對(duì)較少。

表3 農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)大麥抗性愈傷組織形成的影響

農(nóng)桿菌吸附在細(xì)胞表面是T-DNA轉(zhuǎn)移及整合的前提。因此，轉(zhuǎn)化受體在菌液中浸泡的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率也有一定的影響。由表4 結(jié)果可以看出農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為30min時(shí)，獲得的抗性愈傷組織相對(duì)較多。隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，存活的幼胚數(shù)減少，從而抗性愈傷組織獲得率明顯下降。

表4 侵染時(shí)間對(duì)大麥抗性愈傷組織形成的影響

2.3 共培養(yǎng)對(duì)大麥幼胚根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的影響

轉(zhuǎn)化受體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌附著和整合到植物細(xì)胞的階段，共培養(yǎng)成功與否是轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。侵染后的大麥幼胚于固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基共培養(yǎng)3d，共培養(yǎng)結(jié)束后挑取幼胚或愈傷組織進(jìn)行g(shù)us瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)，并比較共培養(yǎng)基中添加半胱氨酸和乙酰丁香酮對(duì)轉(zhuǎn)化的影響(表5)。結(jié)果顯示，不同農(nóng)桿菌侵染大麥幼胚后，液體共培養(yǎng)及固體共培養(yǎng)gus瞬時(shí)表達(dá)率平均值分別為90%，27%。

表5 共培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

注：ASa， 500 uM 乙酰丁香酮； Cysb，800 mg/L半胱氨酸。

半胱氨酸等抗氧化物質(zhì)可以減弱農(nóng)桿菌侵染后對(duì)幼胚造成的組織壞死和細(xì)胞死亡，在液體共培養(yǎng)基中添加了800mg/L 半胱氨酸，結(jié)果幼胚表面的褐化顯著減少，而且轉(zhuǎn)化效率也相對(duì)較高。此外，在共培養(yǎng)基中還添加了500uM乙酰丁香酮(AS)。由于該物質(zhì)可以誘發(fā)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化活力，最終使gus瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到80%。

2.4 高毒力菌株及優(yōu)良受體基因型的篩選

取Golden Promise,秀81-47，schooner,甘啤4號(hào)幼胚愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，共培養(yǎng)3d后隨機(jī)挑取受體組織進(jìn)行組織化學(xué)染色，測(cè)定gus瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果(表6)。從中可看出各菌株的轉(zhuǎn)化結(jié)果明顯不同，說明不同菌株對(duì)轉(zhuǎn)化效果有顯著影響。其中EHA105 gus瞬時(shí)表達(dá)率為52.4%，而C58c1僅為37.3%，相對(duì)于C58c1，EHA105為高毒力菌株。

表6 不同菌株轉(zhuǎn)化大麥幼胚愈傷組織的gus瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)用4個(gè)大麥品種幼胚或愈傷組織作受體，用農(nóng)桿菌C58c1,EHA105分別轉(zhuǎn)化結(jié)果見表7。 結(jié)果表明，不同受體基因型對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性各不相同。其中，Schooner和Golden Promise的gus 瞬時(shí)表達(dá)率均較高，分別為58.3%，56.3%，但是這兩個(gè)品種均為模式品種，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中還是采用秀81-47和甘啤4號(hào)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

表7 農(nóng)桿菌EHA105、C58c1在不同受體基因型中的gus瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果

2.5 抗性愈傷組織的篩選

共培養(yǎng)后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上(未添加選擇壓)過渡培養(yǎng)7～14d，愈傷組織生長(zhǎng)得到恢復(fù)，然后轉(zhuǎn)移到含Hyg 50mg/L的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一步篩選，15d左右出現(xiàn)較多的胚性愈傷組織(圖1C,D)。胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到第2次選擇培養(yǎng)基(Hyg 25mg/L)，約5～7d產(chǎn)生抗性芽(圖1E,F)，同時(shí)部分假抗性愈傷組織開始死亡?？剐栽偕吭俅无D(zhuǎn)移到第2次選擇培養(yǎng)基約5～10d，假抗性再生芽逐漸萎縮死亡，同時(shí)在Hyg作用下未轉(zhuǎn)化愈傷組織分化形成白苗(圖1G,H)。各品種抗性愈傷組織形成見表8。

表8 不同受體基因型大麥抗性愈傷組織形成情況

抗性愈傷組織誘導(dǎo)率為11.2%～58.4%，5種基因型大麥轉(zhuǎn)化30d后獲得的抗性愈傷組織占受體總數(shù)的34.2%。但是該指標(biāo)在不同基因型之間存在較大差異，schooner為58.4%，明顯高于GP。甘啤4號(hào)獲得的抗性愈傷組織較多，抗性愈傷組織誘導(dǎo)率為46.4%，明顯高于秀81-47和秀麥1號(hào)。

3 討論

大麥以幼胚為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道不少[1-4，7-8]，但是基因型依賴、轉(zhuǎn)化后再生苗分化頻率低的問題仍得不到很好的解決。本試驗(yàn)研究了影響轉(zhuǎn)化的重要因素，并進(jìn)行了因素優(yōu)化，初步建立了可用于大麥幼胚的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

在禾谷類作物的遺傳轉(zhuǎn)化中幼胚是首選的轉(zhuǎn)化受體，主要是幼胚具有良好的分化和再生能力。有研究表明幼胚經(jīng)農(nóng)桿菌侵染10～15min將會(huì)降低新鮮剝離幼胚的存活率，而進(jìn)行了預(yù)培養(yǎng)處理的幼胚經(jīng)侵染后能更好地恢復(fù)培養(yǎng)[7]。本研究中預(yù)培養(yǎng)1d的幼胚不僅能耐受30min的侵染，而且在盾片區(qū)域能形成更多數(shù)量的藍(lán)點(diǎn)，這與 Shrawat等的研究結(jié)論一致。此外，Shrawat等在預(yù)培養(yǎng)5d的幼胚中沒有檢測(cè)到gus表達(dá)，但是在本實(shí)驗(yàn)中預(yù)培養(yǎng)4～6d的幼胚均有g(shù)us藍(lán)點(diǎn)分布。這可能是外植體來源差異使得轉(zhuǎn)化受體的感受狀態(tài)有所不同造成的[16]。因此，通過優(yōu)化幼胚預(yù)培養(yǎng)時(shí)間可促進(jìn)T-DNA轉(zhuǎn)移到幼胚再生能力較強(qiáng)的區(qū)域，從而提高轉(zhuǎn)化效率。

本研究所選用的農(nóng)桿菌和轉(zhuǎn)化受體采用液體共培養(yǎng)的方式，提高了轉(zhuǎn)化效率。相對(duì)于固體共培養(yǎng)，液體共培養(yǎng)后幼胚gus瞬時(shí)表達(dá)率較高，這與Hensel[1]等研究結(jié)果一致。此外，此方法還能夠轉(zhuǎn)化時(shí)一次處理較多的受體組織，有效提高工作效率。盡管采用固體共培養(yǎng)獲得的抗性愈傷組織比液體共培養(yǎng)稍多,但是鑒于實(shí)際操作的便利性，液體共培養(yǎng)是值得推薦的共培養(yǎng)方法。

進(jìn)行穩(wěn)定的大麥遺傳轉(zhuǎn)化與所采用的農(nóng)桿菌菌株有關(guān)[17]。大麥幼胚的基因轉(zhuǎn)移一般采用AGL菌系，如AGL0或AGL1[3,18]。本研究中，C58c1是小麥轉(zhuǎn)化中常用的菌株[19]，EHA105多數(shù)用于單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。通過用這兩種農(nóng)桿菌對(duì)大麥不同基因型進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從gus表達(dá)的結(jié)果來看，不同農(nóng)桿菌的致毒力有所不同，盡管兩種菌株均有g(shù)us表達(dá)，但是EHA105相對(duì)C58c1表現(xiàn)更為突出。此外，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將繼續(xù)進(jìn)行AGL1農(nóng)桿菌的侵染力比較實(shí)驗(yàn)。

本研究在共培養(yǎng)基中添加了半胱氨酸和AS以改進(jìn)培養(yǎng)方法。Olhoft 和Somers[20]首次提出半胱氨酸對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后大豆子葉節(jié)細(xì)胞的壞死反應(yīng)有正向促進(jìn)作用。主要是由于這種氨基酸的抗氧化作用使得農(nóng)桿菌侵染后外植體的防御反應(yīng)有所減弱。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。因?yàn)樵谔砑?00 mg/L 半胱氨酸后，侵染后的幼胚不但沒有出現(xiàn)組織壞死和細(xì)胞凋亡，而且添加了半胱氨酸后轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高。

該方法的另一改進(jìn)在于AS的應(yīng)用。眾所周知，AS作為誘導(dǎo)物能被農(nóng)桿菌識(shí)別并且在T-DNA轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。它能誘導(dǎo)細(xì)菌向植物組織傷口的趨向運(yùn)動(dòng)并到達(dá)感受態(tài)細(xì)胞完成基因轉(zhuǎn)移，而且還能激活Vir區(qū)基因。本研究通過在共培養(yǎng)基中添加500 uM AS使得轉(zhuǎn)化效率顯著提高(表5)。與早期用幼胚進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的有關(guān)報(bào)道相比，本實(shí)驗(yàn)中AS的濃度相對(duì)較高，Kumlehn[21]等應(yīng)用大麥花藥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)AS濃度也為500 uM。

供體材料的遺傳背景是影響植物遺傳轉(zhuǎn)化的另一重要因素。對(duì)某些特定種質(zhì)資源如生長(zhǎng)區(qū)域不同或擁有某種特殊感病或抗性的育種品系和品種進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化是更為必要的。Murray[6]等報(bào)道獲得Golden Promise 和3個(gè)澳大利亞品系的轉(zhuǎn)基因株系。來自德國(guó)的 “Igri”是目前采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得轉(zhuǎn)基因植株的唯一冬性大麥品種。本研究發(fā)現(xiàn)春性大麥品種甘啤4號(hào)和秀81-47是對(duì)農(nóng)桿菌較為敏感的基因型，抗性愈傷組織獲得率分別為46.4%，38.3%，甘啤4號(hào)是甘肅省大面積推廣的啤酒大麥優(yōu)良品種，秀81-47是組培特性優(yōu)良的大麥品種，若以這兩個(gè)大麥品種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，有望獲得品質(zhì)加以改良的大麥轉(zhuǎn)基因株系。

圖1 大麥幼胚根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后gus表達(dá)、抗性愈傷組織形成及抗性芽分化

注：A、B：預(yù)培養(yǎng)不同天數(shù)幼胚及愈傷組織gus瞬時(shí)表達(dá)情況；C、D：50mg/L Hyg選擇壓形成的抗性愈傷組織；E、F：25mg/L Hyg 選擇壓形成的抗性芽；G、H： 25mg/L Hyg 選擇壓篩選出的非轉(zhuǎn)化白苗。

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