張曉冬 尹金磊 籍胤璽 關(guān)素珍 郭磊 黃蕾 傅國惠

(南陽市中心醫(yī)院,河南 南陽 473009)

腦卒中是臨床常見的腦部疾病之一。缺血性腦卒中是腦部動(dòng)脈內(nèi)出現(xiàn)斑塊,持續(xù)性誘導(dǎo)海馬組織出現(xiàn)氧血不足,也有部分患者是由于機(jī)體內(nèi)栓子類物質(zhì)循環(huán)進(jìn)入腦部血管,紊亂腦部供血功能,血液流量減少,導(dǎo)致海馬組織出現(xiàn)氧氣和供血不足等事件發(fā)生〔1〕。由于醫(yī)療水平提升,老年化程度增加,導(dǎo)致腦卒中的患病人數(shù)持續(xù)增加。目前,臨床中,對(duì)于該病的治療要采用具體分析,對(duì)癥治療,雖然在一定程度上緩解病情,但是在另一方面也延長了患者的治療時(shí)間〔2〕。原肌球蛋白受體激酶(Trk)B主要分布在海馬區(qū)域,對(duì)大鼠腦部疾病變化較為敏感〔3〕。研究人員在腦部病變大鼠體內(nèi)檢測到Notch1信號(hào)異常表達(dá),首次將Notch1與腦部、神經(jīng)等疾病聯(lián)系起來〔4〕。Notch1表達(dá)水平在人體神經(jīng)性疾病中占重要地位。Notch1是很多關(guān)鍵信號(hào)的交匯點(diǎn),該信號(hào)能直接激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)〔5〕。但在腦卒中、腦梗死等多種腦部疾病中Notch1的作用機(jī)制還較為模糊?，F(xiàn)代藥理研究顯示,醒腦灌腸液具有通腑泄熱、滌痰逐瘀、醒腦開竅之功效,能夠起到擴(kuò)張血管、增加腦血流量、減少微栓塞的作用〔6〕。研究顯示,腦與脾二者在機(jī)體生命活動(dòng)中相互制約又相互依賴,采用健脾、滋補(bǔ)類藥物治療后阿爾茨海默病大鼠的記憶、學(xué)習(xí)能力得要明顯改善,因此,猜測健脾益智膠囊可能對(duì)腦卒中大鼠有治療作用〔7〕。本研究旨在探討醒腦灌腸液聯(lián)合健脾益智膠囊對(duì)腦卒中大鼠TrkB表達(dá)、運(yùn)動(dòng)功能、Notch1信號(hào)的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 在青島市藥品檢驗(yàn)所購買40只健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量220～270 g,鼠齡3～4 w。將所選取的大鼠隨機(jī)分為模型組(M組,制作腦卒中模型)、對(duì)照組(D組,僅在頸部動(dòng)脈處做小切口)、醒腦灌腸液組(X組,建立缺血性腦卒中模型后給予醒腦灌腸液);健脾益智膠囊組(J組,建立缺血性腦卒中模型給予健脾益智膠囊)、醒腦灌腸液聯(lián)合健脾益智膠囊組(L組,建立缺血性腦卒中模型后給予醒腦灌腸液聯(lián)合健脾益智膠囊),每組6只。

1.2模型制備 常規(guī)麻醉大鼠,頸部正中切口,找到頸內(nèi)動(dòng)脈,參照 Longa 線栓法〔8〕,選取規(guī)格為2.0 cm×0.2 mm的阻塞線,將阻塞線插入至大腦中動(dòng)脈的入口,缺血3 h后拔線栓,血管結(jié)扎,創(chuàng)口縫合、消毒。麻醉清醒后觀察其行為學(xué)改變,采用Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔9〕進(jìn)行選擇,0級(jí):行為無明顯變化;1級(jí):左前肢屈曲,左后肢伸展;2級(jí):有左側(cè)追尾現(xiàn)象,左轉(zhuǎn)圈;3級(jí):行走困難,搖擺不定;4級(jí):意識(shí)不清。將評(píng)級(jí)為1、2、3級(jí)的納入實(shí)驗(yàn)。

造模成功后,X組給予醒腦灌腸液,取0.5～1.0 ml水煎劑(濃度為2 g/ml,每劑水煎100～200 ml,根據(jù)成人體重及劑量換算得出)經(jīng)大鼠肛腸深部緩慢滴入腸內(nèi),每日1次。J組給予健脾益智膠囊混懸液15 ml/(kg·d)灌胃,每日1次,L組同時(shí)給予健脾益智膠囊、醒腦灌腸液治療,連續(xù)治療3 w。所有大鼠生存環(huán)境相同。各組模型制備成功后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),完成后處死,開顱取海馬組織用于相關(guān)指標(biāo)測定。醒腦灌腸液由石菖蒲、郁金15 g、大黃、水蛭10 g、冰片3 g組成;健脾益智膠囊由白術(shù)、黃芪20 g、何首烏15 g、人參10 g、遠(yuǎn)志、石菖蒲6 g及水蛭3 g組成。

1.3儀器與試劑 Step one plus PCR儀(生物應(yīng)用,美國);氯仿(江蘇千勝,中國);兔抗人TrkB、Notch1抗體(上海北諾,中國)。

1.4神經(jīng)功能評(píng)分 采用Carcia評(píng)分〔10〕評(píng)定各組神經(jīng)功能,分別從自主活動(dòng)、網(wǎng)屏試驗(yàn)等6個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分為3～18分,得分越低,神經(jīng)功能越差。

1.5運(yùn)動(dòng)功能 使用大鼠抓力計(jì)對(duì)各組大鼠的左前肢抓力進(jìn)行測試。選用倒三角形抓桿,抓桿后方連拉力傳感器,抓桿高度始終保持一致,將大鼠置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,當(dāng)向后拉鼠尾時(shí),大鼠抓住抓桿,繼續(xù)向后拉鼠尾直到實(shí)驗(yàn)人員的拉力超過大鼠前肢的最大抓力,儀器將自動(dòng)記錄大鼠在整個(gè)抓握過程中最大的抓力(單位:g)。測試5次,取平均值。

1.6組織免疫化學(xué)染色法檢測大鼠海馬組織中TrkB蛋白陽性表達(dá)情況 去大鼠大腦海馬組織,做切片常規(guī)脫蠟、水化,加阻斷過氧化物酶,PBS 漂洗,加一抗 TrkB(1∶150),孵育,漂洗,加二抗,重復(fù)以上步驟,甩干后滴加DAB顯色劑,蘇木素,脫水、透明、封片,觀察。

1.7Western印跡檢測Notch1蛋白含量 將海馬組織進(jìn)行裂解并提取核蛋白,并對(duì)核蛋白的濃度進(jìn)行測量,分裝后,保存在-20 ℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液照4∶1的比例進(jìn)行混合,然后將其煮沸,變性。蛋白加脫脂奶粉放聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,封閉。加入1抗,TTBS漂洗3次,加2抗,封閉1 h。TTBS漂洗,DAB顯色,拍照。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測TrkB、Notch1 mRNA表達(dá)量 把保存在-80 ℃環(huán)境中海馬組織取出,研磨,提取總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。所有反應(yīng)嚴(yán)格按照反應(yīng)的條件進(jìn)行擴(kuò)增,內(nèi)參采用GAPDH,變性3 min 95 ℃,變性5 s 95 ℃,退火1 min 60 ℃,共進(jìn)行40次。引物序列:TrkB:上游引物:5′-GAACGACAACCCGACATT3-3′、下游:5′-AGACGTGGATCTGGAGTGA-3′,Notch1:上游引物:5′-GGCG-AACGCACGTT3-3′、下游:5′-GAGACACGCGCGCGT-3′,GAPDH:上游引物:5′-TGGACTCTACTGGCG-TCTT-3′、上游:5′-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3′,取得平均值后得到Ct值,計(jì)算方法用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析,組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及運(yùn)動(dòng)功能比較 各組在神經(jīng)功能及運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分存在時(shí)間、組間相互作用(P<0.01)。與M組相比,X、J、L、D組治療后第10、21天的神經(jīng)功能評(píng)分、運(yùn)動(dòng)功能均明顯升高(P<0.05);與X組及J組相比,L、D組治療后第10、21天的神經(jīng)功能評(píng)分、運(yùn)動(dòng)功能均明顯升高(P<0.05),且D組明顯高于L組(P<0.05)。M、X、J、L組在治療后第1天的神經(jīng)功能評(píng)分及運(yùn)動(dòng)功能比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但D組與其他各組比較兩個(gè)指標(biāo)均明顯升高(P<0.05);組內(nèi)不同時(shí)間相比,各組均隨著時(shí)間的升高神經(jīng)功能評(píng)分及運(yùn)動(dòng)功能均明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分及運(yùn)動(dòng)功能比較

2.2組織免疫化學(xué)染色法檢測TrkB蛋白陽性表達(dá) M組、X組、J組、L組及D組海馬組織中TrkB蛋白陽性數(shù)目分別為(19.52±1.05)、(23.40±1.22)、(24.06±1.09)、(42.71±4.20)及(63.55±6.07)個(gè),組間差異顯著(P<0.05)。D組海馬組織的TrkB陽性蛋白數(shù)最高,M組TrkB蛋白陽性數(shù)目最低,與M、X、J、L組比較,L組TrkB陽性數(shù)目顯著升高(均P<0.05)。X、J組體內(nèi)TrkB陽性數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 TrkB蛋白陽性表達(dá)(蘇木素染色,×200)

2.3Western印跡檢測Notch1蛋白含量 M組、X組、J組、L組及D組海馬組織中Notch1蛋白表達(dá)分別為0.57±0.14、0.58±0.13、0.60±0.10、0.68±0.22及0.85±0.19,組間差異顯著(P<0.05)。D組海馬組織的Notch1蛋白含量最高,M組含量最低,與M、X、J、L組相比較,D組海馬組織中Notch1蛋白含量顯著升高(均P<0.05)。X組、J組海馬組織中Notch1蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 Western印跡檢測各組海馬組織中Notch1蛋白表達(dá)

2.4qRT-PCR法檢測TrkB、Notch1 mRNA表達(dá)量 D組海馬組織的TrkB、Notch1 mRNA表達(dá)量最高,M組mRNA表達(dá)量最低,與M、X、J、L組比較,D組海馬組織TrkB、Notch1 mRNA表達(dá)顯著升高(均P<0.05),X組、J組海馬組織中TrkB、Notch1 mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組海馬組織中TrkB、Notch1 mRNA表達(dá)量

3 討 論

缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型,缺血性腦卒中是由于海馬組織出現(xiàn)長時(shí)間的氧血不足引起腦部疾病。目前,由于組織缺血缺氧造成了廣泛的皮質(zhì)和皮質(zhì)下?lián)p傷,遺留下各種功能障礙,包括:感覺運(yùn)動(dòng)功能、吞咽障礙等,其中,以感覺運(yùn)動(dòng)功能障礙最為多見〔11〕。缺血性腦卒中臨床表現(xiàn)為海馬組織出現(xiàn)病變,神經(jīng)功能喪失、運(yùn)動(dòng)、語言出現(xiàn)障礙等癥狀。因此,該病的發(fā)現(xiàn)時(shí)間與治療時(shí)間與患者預(yù)后呈正相關(guān)關(guān)系,越早的治療,越能控制病情的發(fā)展,對(duì)治療該病有顯著作用〔10〕。

文獻(xiàn)報(bào)道,腦卒中會(huì)使患者出現(xiàn)偏癱、運(yùn)動(dòng)功能障礙等相關(guān)并發(fā)疾病,現(xiàn)今,有許多藥物可以達(dá)到治療效果,但西藥長時(shí)間服用存在一定副作用,本文從兩種不同療效中藥對(duì)腦卒中大鼠模型進(jìn)行試驗(yàn),探究中藥對(duì)腦卒中的改善效果及機(jī)體作用機(jī)制〔12〕。大鼠前肢精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)是腦卒中后治療及康復(fù)手段神經(jīng)功能評(píng)價(jià)的重要研究方向。前肢的感覺-運(yùn)動(dòng)綜合反應(yīng)是由感覺系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)共同參與的復(fù)雜神經(jīng)調(diào)控,除了前肢運(yùn)動(dòng)空間定位,還受到視覺、嗅覺、自我情感等多種因素調(diào)控〔13〕。本研究結(jié)果表明,醒腦灌腸液與健脾益智膠囊對(duì)腦卒中大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)及肢體恢復(fù)均有一定作用,但單一藥物治療效果欠佳,兩種藥物聯(lián)合治療,能夠同時(shí)發(fā)揮藥效,從不同方向進(jìn)行作用。本研究結(jié)果與Taiping等〔14〕研究結(jié)果相符,在大鼠腦卒中發(fā)生后及時(shí)給予醒腦灌腸液進(jìn)行治療,能夠顯著緩解大鼠因腦部缺血所導(dǎo)致的神經(jīng)癥狀,減輕運(yùn)動(dòng)障礙,恢復(fù)前肢運(yùn)動(dòng)能力。研究顯示〔15〕,健脾益智膠囊中白術(shù)、石菖蒲、水蛭等中草藥能夠?qū)δX卒中患者的機(jī)體狀態(tài)、器官功能、臨床癥狀等方面有顯著改善作用,恢復(fù)患者日常生活能力。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示〔16〕,健脾益智膠囊方中人參、黃芪具有強(qiáng)健脾氣、益智寧神、通暢血運(yùn)、以養(yǎng)五臟的功效,何首烏、石菖蒲、水蛭有豁痰醒腦、交通心腎、可補(bǔ)五臟之不足、健脾之功效。健脾益智膠囊對(duì)腦卒中昏迷具有顯著效果,未見明顯不良反應(yīng)。醒腦灌腸液具有通腑泄熱、滌痰逐瘀、醒腦開竅之功效。其中,大黃苦寒,能通腑瀉下,引火下降;郁金性味辛苦、涼,行氣解郁、涼血破淤;冰片能很快透過血腦屏障,增加血腦屏障通透性,起到醒腦開竅的作用;水蛭減輕周圍組織炎癥反應(yīng)的水腫,緩解顱內(nèi)壓,起到逐瘀開竅的作用〔17〕?，F(xiàn)代藥理研究顯示,諸藥具有擴(kuò)張血管、降低血管阻力、減少毛細(xì)血管通透性、增加腦血流量、清除自由基、抑制血小板聚集、降低血黏度、減少微栓塞、改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、改善肢體 運(yùn)動(dòng)功能障礙等作用〔18〕。

Notch信號(hào)通路在人體神經(jīng)性疾病和機(jī)體發(fā)育中都發(fā)揮著重要作用,如介入并調(diào)整了細(xì)胞凋亡、侵襲、遷移及血管的產(chǎn)生等生理病理歷程〔19〕。在不同疾病中,Notch可能通過抑制細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)凋亡來體現(xiàn)自身作用。本研究表明,中藥治療腦卒中大鼠的作用機(jī)制可能與TrkB、Notch1等信號(hào)的表達(dá)水平存在一定的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明〔20〕,通過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合中藥的干預(yù),腦卒中大鼠的BDNF、TrkB蛋白表達(dá)受到了明顯的影響,表明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合中藥治療相對(duì)于單一運(yùn)動(dòng)治療腦卒中后可得到更好的治療效果,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合中藥治療是治療腦卒中的有效方法之一。實(shí)驗(yàn)表明〔21〕,腦卒中大鼠與正常大鼠相比較,體內(nèi)TrkB、Notch1表達(dá)水平存在顯著差異,表明TrkB、Notch1參與腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)〔22〕,醒腦灌腸液與健脾益智膠囊干預(yù)能夠顯著改善腦卒中大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙,緩解前肢抓地情況,同時(shí)促進(jìn)了海馬組織中TrkB、Notch1的表達(dá),繼而推測,醒腦灌腸液與健脾益智膠囊治療可能通過上調(diào)TrkB、Notch1表達(dá)來實(shí)現(xiàn)治療腦卒中大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙的作用。