馬信龍，張華峰，馬劍雄，孫智超，王志鋼，張園，王晨光，楊陽(yáng)

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科(天津300052)

1957年P(guān)ietrogrande和Mastromarino首先報(bào)道了第1例使用糖皮質(zhì)激素引起股骨頭壞死的病例。激素是繼外傷之后引起股骨頭壞死的第二大原因，約占股骨頭壞死的3%～38%，約25%的激素治療的患者會(huì)發(fā)生骨壞死。本研究從生物力學(xué)因素，探究大鼠激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組和造模4月齡健康Wistar大白鼠40只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成兩組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各20只。精確稱重后，分別臀肌注射地塞米松磷酸鈉（20 mg/kg），每周1次，共計(jì)8周。實(shí)驗(yàn)組置于跑步機(jī)中，以1 km/h速度勻速跑動(dòng)，每次30 min，每周2次。跑動(dòng)后，正?；\中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。對(duì)照組生理狀態(tài)下正常負(fù)重，正?；\中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。兩組均于肌肉注射藥物后2、4、6、8周處死，每組每次各5只。

1.2 HE染色取大白鼠左側(cè)股骨頭，去除股骨頭周?chē)浗M織后置入4%多聚甲醛固定液，固定24 h。取大白鼠雙側(cè)股骨頭，盡量去除股骨頭周?chē)浗M織后置入10%中性甲醛固定液，固定24 h。30%甲酸脫鈣3 d，脫鈣完全后，流水沖洗。梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理2 h，石蠟包埋。制成4μm厚切片，常規(guī)HE染色，用雙目Olympus光學(xué)顯微鏡分別在40×、100×、400×下觀察。

1.3 生物力學(xué)測(cè)試（1）取大鼠右側(cè)股骨，去除股骨頭周?chē)浗M織。（2）以生理鹽水浸透紗布，包裹標(biāo)本，置于-30℃速凍，直至測(cè)量。（3）解凍至室溫，以生理鹽水噴涂，保持標(biāo)本濕潤(rùn)。（4）以90“L”形有機(jī)塑料板固定大鼠股骨，使股骨大轉(zhuǎn)子外側(cè)、內(nèi)側(cè)髁和外側(cè)髁遠(yuǎn)端面、分別貼附于有機(jī)塑料板，以黏合劑黏合。（5）“L”形塑料板固定好的股骨標(biāo)本，裝入以1 cm×1 cm為底、高略小于股骨干長(zhǎng)度的卡具，灌入快速自凝牙托粉和牙托水以50 mg:40 mL的比例反應(yīng)成聚甲基丙烯酸甲酯（poly methylmethacrylate，PMMA），至股骨頭下方。（6）采用ElectroForce 3 200生物力學(xué)材料動(dòng)態(tài)力學(xué)性能測(cè)試系統(tǒng)，將包埋好的大鼠股骨標(biāo)本固定到圓盤(pán)上，保證其標(biāo)本固定中心與圓盤(pán)中心一致。（7）在WinTest軟件中，使得Load數(shù)值在零點(diǎn)附近，然后儀器數(shù)值歸零，壓力平臺(tái)以10μm/0.2 s速度下壓股骨頭，壓力感受器記錄范圍0～220 N，每0.2 s，軟件自動(dòng)記錄下累計(jì)時(shí)間（Elapsed Time）、掃描時(shí)間（Scan Time）、位移（Disp,μm）、負(fù)荷（Load,N）、軸向理論位移（Axial cmd，μm）。（8）根據(jù)位移，負(fù)荷，擬合形變—壓力曲線，分析股骨頭剛度、最大形變和壓縮能量吸收。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)觀察正常組織可見(jiàn)：（1）骨小梁結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)則整齊，致密飽滿。（2）骨小梁陷窩內(nèi)可見(jiàn)大量骨細(xì)胞，骨細(xì)胞清晰可見(jiàn)，核較大，位于中央，偶可見(jiàn)空骨陷窩。（3）骨髓腔增生活躍，細(xì)胞分布均勻，造血細(xì)胞豐富，脂肪細(xì)胞與造血細(xì)胞比例正常；網(wǎng)狀纖維無(wú)斷裂現(xiàn)象，骨髓腔內(nèi)血管分布均勻，未見(jiàn)血管出血，偶見(jiàn)巨噬細(xì)胞。

對(duì)照組：2周可見(jiàn)，骨小梁結(jié)構(gòu)基本正常，單位面積內(nèi)骨小梁體積正常，排列規(guī)整；骨細(xì)胞核緊靠一側(cè)骨陷窩壁，固縮，深染，空骨陷窩輕度增多；髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞輕度增生，體積增大，造血組織輕度減少，見(jiàn)圖1。6周可見(jiàn)：骨小梁變細(xì)明顯，結(jié)構(gòu)輕度紊亂，尚未見(jiàn)小梁斷裂現(xiàn)象；空骨陷窩進(jìn)一步增多；骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增多，增大明顯，出現(xiàn)骨髓水腫，見(jiàn)圖2。8周可見(jiàn)：骨小梁?jiǎn)挝幻娣e內(nèi)體積明顯減少，偶見(jiàn)斷裂現(xiàn)象，骨細(xì)胞排列雜亂，見(jiàn)圖3。

實(shí)驗(yàn)組：2周可見(jiàn)，骨小梁較正常變細(xì)，單位面積內(nèi)骨小梁體積減少，排列較規(guī)整；骨細(xì)胞核緊貼一側(cè)骨陷窩壁，固縮，深染，空骨陷窩輕度增多；隨腔內(nèi)脂肪細(xì)胞輕度增生，體積增大，造血組織輕度減少，見(jiàn)圖4。6周可見(jiàn)：骨小梁變細(xì)，間距略增大，體積略減少，結(jié)構(gòu)紊亂，偶見(jiàn)小梁斷裂現(xiàn)象，骨細(xì)胞排列輕度雜亂；骨細(xì)胞變性增多，空骨陷窩增多明顯；骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增多，骨髓水腫。見(jiàn)圖5。8周可見(jiàn)：小梁斷裂現(xiàn)象和游離骨，骨細(xì)胞排列雜亂；空骨陷窩進(jìn)一步增多；骨髓腔內(nèi)出現(xiàn)脂肪細(xì)胞互相融合，造血細(xì)胞減少明顯，骨髓水腫面積增大，見(jiàn)圖6。

2.2 生物力學(xué)測(cè)定以WinTest軟件，每0.2 s自動(dòng)記錄如下參數(shù)：s、μm、N。根據(jù)位移、負(fù)荷，用Origin 7.0，擬合形變—壓力曲線，以y=kx+b形式表示，斜率k即為股骨頭剛度（N/μm），曲線下面積即為股骨頭在該壓縮過(guò)程中吸收能量（N·μm），上述參數(shù)均可由Origin求得。記錄下縱向最大形變、剛度和壓縮過(guò)程能量吸收三個(gè)參數(shù)。

2.2.1 縱向最大形變測(cè)量股骨頭縱向最大形變實(shí)驗(yàn)組對(duì)比對(duì)照組，自第4周起有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），隨著負(fù)重時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組縱向最大形變大于同時(shí)期對(duì)照組。見(jiàn)表1和圖7。

2.2.2 剛度測(cè)量由形變—負(fù)荷曲線斜率，可得股骨頭剛度。股骨頭剛度實(shí)驗(yàn)組對(duì)比對(duì)照組，自第2周起有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。隨負(fù)重時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組剛度小于同時(shí)期對(duì)照組，剛度下降明顯。見(jiàn)表2和圖8。

圖1 對(duì)照組2周，骨小梁結(jié)構(gòu)基本正常，骨小梁體積正常，排列規(guī)整(HE×100)

圖2 對(duì)照組6周，骨小梁變細(xì)明顯，間距增大，結(jié)構(gòu)輕度紊亂，未見(jiàn)小梁斷裂現(xiàn)象(HE×100)

圖3 對(duì)照組8周，偶見(jiàn)骨小梁斷裂現(xiàn)象，較多的空泡陷窩(HE×100)

圖4 實(shí)驗(yàn)組2周，骨小梁較正常變細(xì)，骨小梁體積減少，排列較規(guī)整(HE×100)

圖5 實(shí)驗(yàn)組6周，骨小梁變細(xì)明顯，結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)小梁斷裂現(xiàn)象(HE×100)

圖6 實(shí)驗(yàn)組8周，大范圍骨小梁斷裂現(xiàn)象，出現(xiàn)游離骨(HE×100)

表1 縱向最大形變實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組t檢驗(yàn)(±s,n=20)

表1 縱向最大形變實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組t檢驗(yàn)(±s,n=20)

注：對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)相比較，*P<0.05

2周4周6周8周對(duì)照組245.8±31.0 355.4±29.2 533.4±75.0 646.0±112.8實(shí)驗(yàn)組304.4±40.6 434.0±42.3*565.4±40.2*832.6±60.5*

表2 剛度測(cè)量結(jié)果t檢驗(yàn)(±s,n=20)

表2 剛度測(cè)量結(jié)果t檢驗(yàn)(±s,n=20)

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)相比較，*P<0.05

2周4周6周8周對(duì)照組0.89±0.14 0.63±0.07 0.42±0.08 0.35±0.05實(shí)驗(yàn)組0.74±0.11*0.50±0.06*0.38±0.03*0.27±0.01*

圖7 激素性股骨頭壞死中壓縮股骨頭最大形變

2.2.3 壓縮過(guò)程能量吸收測(cè)量 股骨頭壓縮過(guò)程能量吸收實(shí)驗(yàn)組對(duì)比對(duì)照組，自第2周起有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。隨著負(fù)重時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組能量吸收大于同時(shí)期對(duì)照組，能量吸收增加明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3和圖9。

圖8 激素性股骨頭壞死股骨頭剛度曲線

圖9 激素性股骨頭壞死中股骨頭壓縮過(guò)程能量吸收

表3 壓縮過(guò)程能量吸測(cè)量結(jié)果t檢驗(yàn)(±s,n=20)

表3 壓縮過(guò)程能量吸測(cè)量結(jié)果t檢驗(yàn)(±s,n=20)

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)相比較，P<0.05

2周4周6周8周對(duì)照組26 415.09±2 155.88 41 628.80±1 479.67 58 523.35±709.63 74 090.84±6 790.42實(shí)驗(yàn)組35 334.82±2 547.60 47 335.18±743.54 62 842.68±2 313.63 100 082.62±8 554.9

3 討論

骨的基本代謝過(guò)程是塑形和重建。一般來(lái)說(shuō)，塑形主要通過(guò)增加骨外周直徑、骨皮質(zhì)以及骨小梁的厚度來(lái)增加骨強(qiáng)度[1-2]。骨代謝主要受生物力學(xué)因素的影響和制約，而且在骨組織的重建和塑形過(guò)程，是以其載荷能力足夠適應(yīng)外力環(huán)境為結(jié)果的。

反復(fù)的應(yīng)力改變會(huì)使骨發(fā)生細(xì)微損傷，骨重建過(guò)程可以修復(fù)有限數(shù)量的細(xì)微損傷。當(dāng)骨所發(fā)生的應(yīng)變超出閾值的時(shí)候，將產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)微損傷，并超出骨自身的修復(fù)能力。這種細(xì)微損傷的積累使骨的脆性增加，在有害應(yīng)力下發(fā)生骨折的可能性增加[3]，比如股骨頭無(wú)菌性壞死軟骨下骨的塌陷。

大量實(shí)驗(yàn)證明，長(zhǎng)期使用激素會(huì)導(dǎo)致明顯的骨質(zhì)疏松。在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組單位視野下骨小梁面積，骨小梁寬度較對(duì)照組明顯減少。在力學(xué)測(cè)試中可以發(fā)現(xiàn)，隨著負(fù)重時(shí)間的增加，股骨頭的剛度、最大位移，以及在該過(guò)程中吸收的能量在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間同樣均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明在激素的作用下隨著負(fù)重的增加，股骨頭的剛度在逐漸下降，抗應(yīng)力的能力在隨之下降。

在實(shí)驗(yàn)中，我們不難看到，隨著激素的使用，股骨頭從第2周開(kāi)始，出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松，鏡下病理觀察實(shí)驗(yàn)組中股骨頭小梁的斷裂程度，要高于對(duì)照組。即是說(shuō)，應(yīng)力因素對(duì)于骨小梁的破壞，起到了一個(gè)至關(guān)重要的作用。

從力學(xué)測(cè)定結(jié)果的角度分析，股骨頭的剛度可以直接反映骨質(zhì)疏松情況，由于力作用的強(qiáng)度恒定（200 N），最大位移和壓縮能量吸收成為了另外兩個(gè)衡量股骨頭質(zhì)量的參數(shù)。即是說(shuō)，當(dāng)被測(cè)骨質(zhì)在恒定的力作用下，被壓縮的形變?cè)酱?，其骨質(zhì)質(zhì)量越差，骨質(zhì)疏松越嚴(yán)重。由于能量為力對(duì)于位移的積分，為負(fù)荷—形變曲線下面積，所以壓縮能量越大，骨質(zhì)疏松越嚴(yán)重。我們實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果，最大位移、壓縮能量吸收隨著激素作用的時(shí)間延長(zhǎng)而增加，而剛度在逐漸下降，這一結(jié)果符合股骨頭壞死的骨質(zhì)疏松特點(diǎn)。我們?cè)谶M(jìn)行生理負(fù)重和超負(fù)重比較的過(guò)程中，不難發(fā)現(xiàn)，隨著負(fù)重量的累計(jì)，股骨頭的剛度下降更為嚴(yán)重，而最大位移和能量吸收也在隨之增加，對(duì)比正常負(fù)重，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一數(shù)據(jù)和上述骨小梁面積、寬度基本吻合，即是說(shuō)，在股骨頭壞死過(guò)程中，負(fù)重情況下，骨小梁的損壞程度更為嚴(yán)重。

在力學(xué)測(cè)定中，使受力方向和主壓力小梁一致，逐漸增大負(fù)荷程度，正常的骨組織會(huì)有一個(gè)彈性形變過(guò)程。在實(shí)驗(yàn)組中，隨著骨質(zhì)疏松的加劇，以及骨小梁斷裂程度的增加，股骨頭壓縮變?yōu)橐粋€(gè)不可逆過(guò)程，進(jìn)而剛度等生物力學(xué)參數(shù)發(fā)生一系列變化。在激素性股骨頭壞死的發(fā)病中，其主要原因是骨質(zhì)疏松的逐漸加劇，當(dāng)股骨頭負(fù)重區(qū)不再適應(yīng)原有應(yīng)力的強(qiáng)度的時(shí)候，骨小梁發(fā)生形變，即發(fā)生斷裂，骨小梁骨折。隨著激素和外界應(yīng)力作用的累計(jì)，這些不可逆應(yīng)變逐漸超過(guò)了骨質(zhì)本身的修復(fù)作用，使得骨小梁的斷裂骨折成為不可逆過(guò)程，進(jìn)而啟動(dòng)骨細(xì)胞凋亡等一系列過(guò)程，最終造成股骨頭壞死。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，激素性股骨頭壞死和力學(xué)因素有密不可分的關(guān)系。在該過(guò)程中，激素造成股骨頭的骨質(zhì)疏松，骨質(zhì)的生物力學(xué)性能隨著激素的使用逐漸下降，當(dāng)骨質(zhì)不再適應(yīng)外界的力學(xué)環(huán)境的時(shí)候，骨小梁會(huì)出現(xiàn)逐步的斷裂，形成骨小梁骨折，股骨頭塌陷，繼而骨細(xì)胞凋亡，最終出現(xiàn)股骨頭壞死。

[1]Frost HM.From Wolff's Law to the Utah paradigm:insights about bone physiology and its clinical applications[J].Anat Rec，2001，262(7):398.

[2]eewss.Integrated bone tissue physiology：anatomy and physiology[M].Bone Mechanics Handbook，2001:1-68.

[3]Reddi AH.Aging，osteoarthritis and transforming growth factorbe?ta signaling in cartilage[J].A rthritis Res Ther，2006,8(1):101.